23. Ulusal Biyokimya Kongresi Özel Sayısı - Türk Biyokimya Dergisi

XXIII. ULUSAL B‹YOK‹MYA KONGRES‹
29 Kasım - 2 Aralık 2011
Hilton Hotel - Adana
23. Ulusal Biyokimya Kongresi, Adana [23 rd National Biochemistry Congress, Adana / TURKEY]
İÇİNDEKİLER
P. 145 / MİTOKONDRİYAL DNA GENOMU TEK NÜKLEOTİD
POLİMORFİZMİNİN REAL TIME PCR CİHAZI İLE
İDANTİFİKASYONU VE STANDARDİZASYONU
Kadir DAŞTAN, Ersi Abacı KALFOĞLU
Fen Bilimleri Anabilim Dalı, İstanbul Üniversitesi, Adli Tıp Enstitüsü, İstanbul
P. 145 / IDENTIFICATION AND STANDARDIZATION OF
MITOCHONDRIAL DNA SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM
WITH REAL-TIME PCR INSTRUMENT
Kadir DAŞTAN, Ersi Abacı KALFOĞLU
Department of Sciences, Istanbul University, Institute of Forensic Medicine
CONTENTS
mtDNA Real Time PCR analizi biyolojik delillerin değerlendirilmesinde çok önemli
bir araç olarak ortaya çıkmaktadır. Özellikle az miktardaki örneklerde başvurulması
gereken ileri derecede bir incelemedir. Günümüzde, çeşitli mtDNA polimorfik bölgeleri
Adli Bilimler uygulamalarına kazandırılmaktadır. Bu durumda mtDNA’nın son derece
yüksek bir dışlama gücüne ulaşacağı kesindir. Ancak, mtDNA genotipleme analizi
yeni bir sistem olduğundan, yeni mutasyonların adlandırılmasından, heteroplazmi
olayının izlenmesine kadar her noktanın dikkatle uygulanması gerekmektedir.
Avrupa popülasyonu düşünüldüğünde kişilerarası ortalama 8 nükleotidte farklılık
görülmektedir. Bu 8 farklılıktan biri, 7025. bazda meydana gelen polimorfizmdir.
Bu bölgenin sağlıklı 10 gönüllüden aldığımız serum numunelerinde polimorfik olup
olmadığının oldukça hızlı ve güvenilir sonuç veren ve floresans işaretli primerlerin
kullanılması prensibi esası ile çalışan Real Time PCR cihazı ile analizine dayanarak
bir ön tarama çalışması yapmayı hedefledik.
Her ne kadar çalışmamızda denek grubu 10 kişiden oluşmuş olsa da, başarılı bir
genotipleme yapılabilmiş ve sonuçlar literatür bilgisi ile karşılaştırılmıştır. Buna göre,
GT kontrol SNP, ilk olarak ve çoğunlukla bilinmeyen mtDNA örneklerinin kalitesini
araştırmak için kullanılmaktadır. Bu SNP’nin kullanımı ile, 10 mtDNA örneğinden
8’ini başarı ile genotipledik. 2 mtDNA örneğinden düşük floresans sinyal elde ettik. 10
numaralı örnek, OD ölçümüne göre çok düşük miktarda mtDNA içermekteydi. Elde
ettiğimiz tüm Real-Time analiz sonuçlarına göre, farklı genotipler Amplifluor Real-
Time metodu kullanılarak belirlenebilmiştir. Sonuçlar, konvansiyonel Amplifluor
end-point metodu ile konfirme edilmiştir.
Dünya çapında birçok laboratuarda idantifikasyon amacı ile sıklıkla başvurulan bu
yöntemle ilgili olarak ülkemizde faaliyette bulunan kriminal laboratuvarlarda hala
ciddi bir çalışma yoktur. Bu nedenle çalışmamızda yöntemin standardizasyonunun
sağlanması ve bu mutasyonla ilgili bir ön bilgi edinilmesi amaçlanmıştır.
It is not always possible to obtain enough nuclear DNA sample for the analysis of
the biological samples in the purpose of forensic evaluations. The polymorphic DNA
found in the mitochondria matrix exist at least a hundred copies and it makes easy
to obtain results. Where it is not possible to work with nuclear DNA, mtDNA gives
successfull results. The aim of this study was to have a preliminary information for
the genotyping of the mtDNA and to obtain data about the mutation in 10 healthy
volunteers.
The development of a one step, PCR-based, universal detection method, the
Amplifluor® SNPs Genotyping System, simplifies high throughput analysis for the
genotyping of SNPs. The Amplifluor® SNPs Genotyping System is a highly sensitive,
homogeneous fluorescent assay. It can be adapted to virtually any sample that can be
analyzed by allele-specific PCR.
The 7025th SNP site of the mtDNA was genotyped with Real-Time PCR instrument
and the haplotypes were evaluated compared to standart end-point PCR results for
understanding the applicability of Real-Time PCR in genotyping mtDNA for forensic
purposes. Blood samples were collected from 10 unrelated individuals and mtDNA
was extracted with a commercially available kit. The target regions were amplified by
means of Real-Time PCR instrument and then the products were genotyped by using
an appropriate labelling for the universal Amplifluor fluoresence method.
Even if our study group had consisted of 10 volunteers, we could have a successfull
genotyping for 8 samples and compare the results with the current literature.
Turk J Biochem, 2011; 36 (S2)
http://www.TurkJBiochem.com