CONTRIBUCION A LA BIOLOGIA E INMUNOLOGIA DE Toxocara ...

a) - Preparar una solución de pepsina en tampón citrato 0,1 M, pH 3,5
a una concentración de 2 mg/ml.
b) - Fraccionar y congelar rápidamente a —3090
c) — Centrifugar el anticuerpo monoclonal TC—l, purificado previamente
mediante precipitación con ácido caprílico y sulfato amónico
saturado (3.2.15.), a 490 y 3.000 r.p.m. durante 20 minutos.
Resuspender el precipitado en tampón P.B.S..
d) - Dializar a 490 frente a tampón citrato 0,1 M, pH 6 durante toda
la noche y posteriormente frente a tampón citrato 0,1 M, pH 3,5
durante cuatro horas.
e) — Ajustar el pH a 3,5 con tampón citrato 1 M, pH 3,5.
f) - Medir la concentración por lectura de la D.O. a 280 rin, teniendo
en cuenta que la concentración óptima para la digestión debe es-
tar comprendida entre 1 y 4 mg/ml.
g) — Para el procesamiento posterior mediante electroforesis en
SDS—PAGE, tomar dos alícuotas de 10 ul de la muestra del
anticuerpo inonoclonal 10—1 antes de hacer la digestión, sobre 5
ul de tampón Tris 3 M, pH 8. Conservar a —2090.
h) — Transferir la solución de pepsina en bailo de hielo, sobre la
muestra de anticuerpo monoclonal a digerir. Para la reaccion de
digestión la relación enzima—proteina será de 1:60.
i) - Incubar durante 90 minutos a 3790 en baño de agua.
j) — Frenar la reacción elevando el pH a 7 mediante la adición de
tampón Tris 3 M, pH 8 en la proporción indicada en el apartado
g), fraccionar y congelar a —2090. Seleccionar dos alícuotas de
10 ul para su procesamiento posterior en geles de SDS—PAGE.
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