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allo spettrofotometro ottenendo i valori di ratio e resa
(µg/ml). Quindi si è eseguita amplificazione per due housekeeping
gene: Bcl-6 (100 paia di basi) e HLA-DQ_ (242 paia
di basi).
Risultati. Nella seria A la ratio variava da 1,27 a 1,82 (media
1,53), mentre nella serie B la ratio era compresa tra 1,80 a
2,00 (media 1,89). Per la serie A la resa variava da 58 a 343
µg/ml e da 12 a 30 µg/ml per la serie B. Tuttavia mentre
l’amplificazione per Bcl-6 e HLA-DQ_ era positiva in 46 dei
50 casi della serie B (92%), essa era costantemente negativa
per la serie A (0%). La valutazione comparativa delle schede
tecniche dei coloranti per Papanicolaou delle ditte A e B ha
rilevato che nei coloranti della ditta A (Ematossilina e EA50)
era presente acido acetico in percentuale inferiore al 5%,
mentre negli stessi coloranti della ditta B l’acido acetico non
era presente.
Conclusioni. La drammatica differenza osservata nei risultati
della PCR è verosimilmente dovuta al noto effetto di
degradazione che l’ambiente acido esercita sul DNA 1 . Questa
osservazione rende auspicabile l’attento studio delle
schede tecniche di prodotto e l’adozione di metodiche
molecolari di controllo sui reagenti in uso. Se entrambi i
prodotti valutati sono perfettamente idonei alla pura morfologia,
nel prodotto A esistono componenti capaci di
degradare il DNA a frammenti inferiori a 100 bp e di non renderlo
più idoneo ai fini diagnostici.
Bibliografia
1 Bonis S, et al. J Clin Pathol 2005;58:313-6.
Utilizzo di metodica immunoistochimica e
metodica FISH per la valutazione di EGFR nei
carcinomi colorettali
A. Bernardi, E. Berno ** , A. Crova * , G. Canavese, P. Lovadina,
E. Margaria, N. Martinetti, E. Berardengo
S.C. Anatomia Patologica, ASO “San Giovanni Battista” di
Torino, Presidio Ospedaliero “San Giovanni” Antica Sede
(TO); * S.C. Oncologia Medica 2, ASO “San Giovanni Battista”
di Torino, Presidio Ospedaliero “San Giovanni” Antica
Sede (TO); ** Oncologia Medica, Ospedale “Gradenigo”,
Torino
Introduzione. Il recettore del fattore di crescita epidermale
(EGFR), codificato dal gene omonimo sul cromosoma 7p12,
appartiene alla famiglia dei recettori tirosinachinasici. La
deregolazione del suo sistema di segnale determina: crescita
cellulare incontrollata, diminuzione dell’apoptosi, stimolo
dell’angiogenesi e proliferazione cellulare. EGFR è over
espresso in vari tumori solidi tra cui quelli colorettali e rappresenta
un target di terapia mirata. Secondo dati di letteratura
la probabilità di efficacia del trattamento non è prevista applicando
un singolo metodo di dosaggio di EGFR, ma dalla
combinazione di più metodi. In un lavoro preliminare si eseguiva
la reazione di Ibridazione in Situ in Fluorescenza
(FISH) su 30 prelievi istologici di pazienti già chemiotrattati,
da una casistica comprendente 114 tumori primitivi del
grosso intestino e 30 metastasi epatiche da carcinomi (ca)
colorettali, in totale 144 casi, precedentemente studiati con
metodica immunoistochimica (IHC).
Metodi. Su sezioni di 4 µm di 144 prelievi istologici fissati
in formalina ed inclusi in paraffina si eseguiva IHC con il kit
K1492 (Dako) FDA approvato per la visualizzazione della
FREE PAPERS
proteina EGFR e trattamento con terapia mirata Erbitux. Si
consideravano IHC positivi i campioni con positività di
membrana completa e/o incompleta in un numero di cellule
> 0% (aggiornamento FDA 09/06). Su 30 dei prelievi istologici
IHC positivi si eseguiva FISH con EGFR-CEN7 Fish
kit (Dako). Si consideravano FISH positivi i campioni con
Ratio ≥ 2, o con polisomia > 4 copie di gene in ≥ 40% nuclei
analizzati. Quattro pazienti dei trenta erano trattati secondo il
protocollo Erbitux.
Risultati. Si trovava il 64% di positività IHC e il 36% di positività
FISH senza alcuna correlazione significativa di p ≤
0,01 tra le due metodiche. Dei pazienti trattati con Erbitux:
due IHC positivi/FISH negativi non rispondevano alla terapia
con progressione della malattia e decesso, due, IHC/FISH
positivi (uno con amplificazione del gene EGFR, l’altro con
netta polisomia) rispondevano bene al trattamento.
Conclusioni. In un lavoro preliminare su campioni da ca colorettale
non risulta correlazione tra espressione proteica e
stato del gene EGFR. Il numero di copie del gene potrebbe
interferire con la risposta all’Erbitux. Come da letteratura si
conferma che il dosaggio di EGFR è da affidare ad una combinazione
di più metodi d’indagine per l’eterogeneità di stato
ed espressione del gene nelle cellule tumorali.
Espressione di PTEN e risposta a cetuximab in
pazienti affetti da carcinoma colorettale
metastatico
M. Frattini, V. Martin, E. Romagnani * , M. Ghisletta, A.
Camponovo, L. Lunghi-Etienne, P. Saletti * , L. Mazzucchelli
Istituto Cantonale di Patologia, Locarno, Svizzera; * Istituto
Oncologico della Svizzera Italiana, Bellinzona, Svizzera
Introduzione. Cetuximab, che ha come bersaglio molecolare
EGFR, è un farmaco assai promettente per il trattamento di
pazienti con carcinoma colorettale metastatico (mCRC). Attualmente
è oggetto di intenso dibattito se alterazioni genetiche
degli effettori innescati da EGFR, come K-Ras, possano
influenzare la risposta a tale farmaco. Il ruolo di PTEN,
la cui assenza di espressione predice resistenza a trastuzumab
in pazienti con carcinoma mammario, non è ancora stato
investigato. Scopo del presente lavoro è quello di analizzare
lo stato genico di EGFR, di K-Ras e l’espressione proteica di
PTEN in pazienti con mCRC e correlare i dati molecolari con
il dato clinico di risposta cetuximab.
Metodi. Abbiamo analizzato 27 pazienti consecutivi con
mCRC. L’espressione di EGFR è stata indagata con il kit
PharmDx (Dako), lo stato genico di EGFR con FISH utilizzando
le sonde LSI EGFR/CEP7 (Vysis). Le mutazioni di K-
Ras sono state analizzate con sequenziamento diretto e l’espressione
di PTEN con l’anticorpo primario della ditta Neomarkers.
Un campione è stato definito come amplificato per
EGFR quando l’amplificazione genica è stata osservata in almeno
il 10% delle cellule. La marcata polisomia è stata
definita quando almeno 3 copie del cromosoma 7 sono state
osservate in più del 50% delle cellule. Per ogni campione
sono state valutate almeno 100 cellule.
Risultati. Undici pazienti hanno mostrato risposta parziale
(PR) al cetuximab, 3 hanno mostrato stabilità della malattia
(SD) e 13 progressione (PD). SD e PD sono stati considerati
come non rispondenti (NR). In tutti i pazienti è stata osservata
espressione di EGFR a livello immunoistochimico. Otto