Effet chez le porcelet d'une exposition à un régime co-contaminé en ...

TRAVAIL EXPERIMENTAL7) Détermination de l’index de prolifération des lymphocytesComme expliqué dans le chapitre 1, la prolifération des lymphocytes a pu être déterminée aprèsla mise en culture du sang total, et stimulé avec un mitogène et/ou un antigène (ovalbumine). Lastimulation mitogénique du sang total (dilué au 1/15 ème ) avec la concanavaline A (10 µg/mL) nous apermis d’évaluer la réponse cellulaire non-spécifique. A l’inverse, la réponse cellulaire spécifique aété étudiée après la stimulation du sang total (dilué au 1/15 ème ) en présence d’ovalbumine (5 et 10µg/mL). Des cultures cellulaires contrôles, non stimulées ont aussi été inclus. Après 48h destimulation, nous avons rajouté de la thymidine radio-marquée (tritium 3 H, 0,5 µCi/puit) au milieu deculture, et laissé à incuber 24 heures supplémentaires. Les cultures cellulaires ont ensuite étéstockées à -20°C. Après filtration des cultures, les niveaux de thymidine tritiée incorporée ont étémesurés à l’aide d’un compteur à scintillation (Kontron Instrument, Mila, Italie). L’index deprolifération des lymphocytes a été exprimé en cpm mesurés dans les cultures stimulées/cpmmesurés dans les cultures contrôles non stimulées.8) Détermination de l’expression des ARNm codant des cytokinesAfin d’extraire les ARNs de la rate, les échantillons collectés à l’autopsie et congelés à -70°C, ontété broyés au FastPrep-24 (MP Biomedicals, Ilkirch, France) via l’utilisation de tubes de lyse (MPBiomedicals) contenant du thiocyanate de guanidine (Extract-All®, Eurobio, les Ulis, France), et suivid’une extraction au phénol chloroforme. Comme mentionné dans le chapitre 1, les concentrations,l’intégrité et la qualité des ARNs ont été déterminées au spectrophotomètre Nanodrop ND1000(Labtech International, Paris, France). Les étapes de transcription inverse et de PCR temps réel ontété réalisées comme précédemment. Des ARNs non-inversement transcrits ont été utilisés commecontrôle pour vérifier que nous n’amplifions pas d’ADN génomique. En plus de cela, nos amorcesétaient situées sur deux exons différents, limitant ainsi l’amplification d’ADN génomique. Laspécificité des produits PCR a été contrôlée à la fin de la réaction par l’analyse de la courbe dedissociation. Basé sur la méthode de Peirson et al. (2003), également nommé DART-PCR (DataAnalysis for Real Time-PCR), nous avons pu déterminer l’efficacité d’amplification de chaqueéchantillon, et ainsi la fluorescence initiale de chaque matrice d’ADNc. Cette approche rend possiblel’analyse de chaque échantillon expérimental, basé sur sa propre réaction de cinétique plutôt que surcelle de standards artificiels. Enfin, les valeurs de fluorescence ont été normalisées par celle de deuxgènes de ménage, la β2-µglobuline et la protéine ribosomale L32, et l’expression des gènes a étéexprimée par rapport au groupe contrôle.147