Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

YCR010c
YDR384c
YNR002c
18S RNA
VK
Acetat Ethanol ohne C-Quelle
0h 1h 2h 3h 4h 20h 0h 1h 2h 3h 4h 20h 0h 1h 2h 3h 4h 20h
Ergebnisse
Abb. 31: Expression von YCR010c, YDR384c und YNR002c im Stamm YN. Die Zellen
wurden üN bis zu einer OD600 von 0,1 in MG-Flüssigmedium kultiviert, einmal mit
1 x Readersalzen gewaschen und eine weitere Vorkultur 4 h in MG-Medium geschüttelt.
Danach wurden die Zellen abzentrifugiert, einmal mit 1 x Readersalzen
gewaschen und die Hauptkulturen mit einer OD600 von 0,1 angeimpft. Es wurden
50 ml Probe von der zweiten Vorkultur (VK) und zu den angegebenen Zeiten von
den Hauptkulturen jeweils 50 ml Probe genommen und die RNA isoliert. Die Abbildung
zeigt den entwickelten Northern-Blot, der mit der YCR010c-, YDR384c-
und YNR002c-Sonde beprobt wurde. Für den Vergleich der RNA-Konzentrationen
diente die 18S RNA als Standard.
In der zweiten Vorkultur (VK) mit Glucose als C-Quelle konnte nur die RNA von YDR384c
nachgewiesen werden, von YCR010c und YNR002c konnte keine RNA detektiert werden.
Auf den ausgewählten C-Quellen Acetat bzw. Ethanol und Medium ohne C-Quelle wurden
alle drei Homologen exprimiert. Am stärksten wurden sie auf Minimalmedium mit Ethanol als
C-Quelle induziert. Am niedrigsten war die Expression aller drei Homologen auf Acetat. Die
Expressionsstärke auf Medium ohne C-Quelle lag zwischen der von Ethanol und Acetat,
YCR010c und YNR002c wurden etwa gleich stark induziert, die Expression von YDR384c
war dagegen etwas schwächer.
Im folgenden Versuch sollten die im Northern-Blot gewonnenen Daten im Western-Blot auf
Proteinebene überprüft werden. Es wurde die Expression der mit dem HA-Tag fusionierten
Proteine Ycr010cp, Ydr384cp und Ynr002cp im Stamm YN analysiert. Die Ergebnisse der
entwickelten Western-Blots sind in Abb. 32 dargestellt.
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