Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

Inhaltsverzeichnis
2.7.2 Saccharomyces cerevisiae ............................................................................... 31
2.7.3 Yarrowia lipolytica ............................................................................................. 33
2.8 Kultivierungsmedien................................................................................................ 33
2.8.1 Kultivierungsmedium für Escherichia coli.......................................................... 33
2.8.2 Kultivierungsmedien für Saccharomyces cerevisiae und Yarrowia lipolytica.... 33
2.9 Gentechnische Arbeitsmethoden............................................................................ 35
2.9.1 Agarosegel-Elektrophorese............................................................................... 35
2.9.2 Restriktionsspaltungen...................................................................................... 36
2.9.3 Ligation von DNA-Fragmenten.......................................................................... 36
2.9.4 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) ................................................................. 36
2.9.5 Isolierung von DNA aus Agarosegelen ............................................................. 37
2.9.6 Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli ............................................ 37
2.9.7 Isolierung von DNA aus Hefen.......................................................................... 37
2.9.8 Isolierung von RNA aus Saccharomyces cerevisiae......................................... 38
2.9.9 Northern-Hybridisierung.................................................................................... 39
2.9.10 Transformation von Mikroorganismen............................................................... 41
2.9.10.1 Herstellung und Transformation elektrokompetenter Escherichia coli-
Zellen (modifiziert nach Dower et al., 1988)............................................. 41
2.9.10.2 Herstellung und Transformation kompetenter Saccharomyces
cerevisiae-Zellen ...................................................................................... 41
2.9.10.3 Herstellung und Transformation elektrokompetenter Yarrowia
lipolytica-Zellen (modifiziert nach Dower et al., 1988).............................. 41
2.9.10.4 Integrative Transformation von Yarrowia lipolytica................................... 42
2.9.11 DNA-Sequenzierung ......................................................................................... 42
2.9.12 Southern-Hybridisierung ................................................................................... 42
2.9.13 Plasmidkonstruktionen...................................................................................... 43
2.9.14 Konstruktion des Yarrowia-lipolytica-Stammes PO1d-GPR1-2 ........................ 47
2.10 Biochemische Methoden......................................................................................... 47
2.10.1 Zellaufschluss mittels Glasperlen...................................................................... 47
2.10.2 Proteinbestimmung nach Lowry et al. (1951).................................................... 48
2.10.3 Deglycosylierung............................................................................................... 48
2.10.4 Dephosphorylierung.......................................................................................... 48
2.10.5 SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) ....................................... 48
2.10.6 Western-Blot-Analyse ....................................................................................... 50
2.10.7 Immunochemischer Nachweis geblotteter Proteine.......................................... 50
2.10.8 Photometrische Bestimmung von Ammonium (modifiziert nach Palková
et al., 2002) ....................................................................................................... 50
II