Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

Material und Methoden
Die PCRs wurden in 50-100 µl Ansätzen wie folgt angesetzt:
Template 15 ng Plasmid-DNA oder 30-60 ng genomische DNA
Primer jeweils 1,5 µl (SL: 10 pmol/µl)
dNTPs 2 µl (SL: 10 mM pro dNTP)
Reaktionspuffer 5-10 µl (SL: 10 x)
MgSO4 oder MgCl2 5-10 µl (SL: 25 oder 50 mM)
Polymerase 0,5 µl (SL: 5 U/µl)
Die von Pogulis et al. (1996) beschriebene rekombinante PCR (OEP: „Overlap Extension
PCR”) wurde für Punktmutationen, Insertionen und Fusionen an beliebigen Stellen eines
Genes verwendet.
Die zur zufälligen Mutagenese angewandte PCR-Methode ist in Kapitel 2.9.13 beschrieben.
2.9.5 Isolierung von DNA aus Agarosegelen
Zur Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen wurde der „JETQUICK Gel Extraction
Spin Kit“ oder der „JETSORB Gel Extraction Kit“ benutzt und nach Herstellerangaben
verfahren.
2.9.6 Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli
Plasmid-DNA wurde aus 2 ml einer üN-Kultur (LB-Flüssigmedium mit Ampicillin) nach der
Methode von Birnboim and Doly (1979) gewonnen. Für Sequenzierungen wurde die Plasmid-DNA
mit Hilfe des „JETQUICK Plasmid Miniprep Spin Kit“ isoliert.
2.9.7 Isolierung von DNA aus Hefen
Für die Präparation chromosomaler DNA und zur Rückisolierung von Plasmiden aus den
Hefen S. cerevisiae und Y. lipolytica wurde die Methode nach Hoffman and Winston (1987)
angewandt.
Es wurden 10 - 20 ml einer üN-Kultur bei 3000 x g für 5 min abzentrifugiert und das Pellet in
200 µl TEST-Puffer resuspendiert. Weiterhin wurden 200 µl Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol
(25:24:1) und ca. 0,3 g Glasperlen (Ø 0,45 mm) zugesetzt und die Zellen 3 min durch
kräftiges Schütteln aufgeschlossen. Danach wurden 200 µl TE-Puffer zugegeben und der
6400 x g Überstand ein weiteres Mal mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol und anschließend
zweimal mit Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) extrahiert.
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