Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

2.9.10 Transformation von Mikroorganismen
Material und Methoden
2.9.10.1 Herstellung und Transformation elektrokompetenter Escherichia coli-Zellen
(modifiziert nach Dower et al., 1988)
400 ml LB-Flüssigmedium wurden mit 4 ml einer E. coli-üN-Kultur beimpft und auf dem
Schüttler bei 37 °C inkubiert. Nach Erreichen einer OD600 von 0,5 - 0,8 wurden die Zellen
15 min auf Eis gestellt und anschließend abzentrifugiert (4000 x g, 15 min, 4 °C). Nach
zweimaligem Waschen mit eiskaltem dH2O (400 ml bzw. 200 ml) wurden die Zellen einmal
mit 20 ml 10%igem (v/v) Glycerol gewaschen. Das Pellet wurde in 2 ml 10%igem (v/v) Glycerol
resuspendiert und in 40 µl Portionen mit Trockeneis/Ethanol schockgefroren. Die Zellen
wurden bei -80 °C gelagert.
Zur Transformation wurden 40 µl Zellen mit der DNA-Lösung (4 µl Ligationsansatz oder ca.
25 ng Plasmid-DNA) gemischt und in Elektroporationsküvetten (0,2 cm von PeqLab, vorge-
kühlt) gegeben. Nach der Elektroporation bei 25 µF, 200 Ω und 2,5 kV wurde sofort 1 ml
SOC-Medium zugegeben und die Zellen 1 h bei 37 °C inkubiert. Nach Ausplattieren des Ansatzes
auf LB-Platten mit Ampicillin erfolgte üN die Inkubation bei 37 °C.
SOC-Medium: Glucose 20 mM
Hefeextrakt 0,5 % (w/v)
KCl 2,5 mM
MgCl2 10 mM
NaCl 10 mM
Pankreatisches Pepton aus Casein 2 % (w/v)
2.9.10.2 Herstellung und Transformation kompetenter Saccharomyces cerevisiae-
Zellen
Die Herstellung und Transformation kompetenter S. cerevisiae-Zellen wurde wie bei Dower
et al. (1988) beschrieben durchgeführt. Die kompetenten Hefezellen wurden mit ca. 10 bis
15 ng Plasmid-DNA transformiert.
Zur integrativen Transformation von S. cerevisiae wurden 50 bis 500 ng Fragment-DNA (YIp-
Konstrukte, mit StuI geschnitten) verwendet.
2.9.10.3 Herstellung und Transformation elektrokompetenter Yarrowia lipolytica-Zellen
(modifiziert nach Dower et al., 1988)
Diese Methode wurde für die Transformation von Y. lipolytica mit autonom replizierenden
Hefevektoren verwendet.
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