Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

Ammoniumsekrteion in mg*ml-1*min-1
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
YN
YNDycr
YNDydr
YNDynr
YNDycrDydr
YNDycrDynr
YNDydrDynr
YNDycrDydrDynr
Ergebnisse
Abb. 44: Ammoniumsekretion der verschiedenen YN-Stämme (nach Dillschneider, 2003).
Die Stämme wurden üN in MG-Flüssigmedium kultiviert, einmal mit 1 x Readersalzen
gewaschen und auf GM-Medium getropft. Nach 12 d Inkubation bei 28 °C
wurden die Zellen mit MES-Puffer gewaschen und die Ammoniumsekretion über
25 min bestimmt.
3.3.16.2 Einfluss der dominanten Mutationen in Ycr010cp und Ynr002cp auf die Produktion
von Ammonium
Es war weiterhin von Interesse zu prüfen, inwieweit die dominanten Mutationen von
Ycr010cp bzw. Ynr002cp (Ycr010cp-Q75, Ycr010cp-D259, Ynr002cp-Q74, Ynr002cp-D259)
eine Auswirkung auf die Ammoniumproduktion hatten. Die Wildtypallele YCR010c bzw.
YNR002c und deren Mutantenallele (YCR010c-Q74, YCR010c-D259, YNR002c-Q74,
YNR002c-D259) wurden integrativ in die Stämme YNΔycr bzw. YNΔynr transformiert. Der
Nachweis der korrekten Integration dieser Allele erfolgte mit Hilfe der Southern-
Hybridisierung.
Die genomische DNA des Ausgangsstammes YNΔycr und dessen Transformanden wurde
isoliert und mit dem Restriktionsenzym EcoRV geschnitten. Nach Auftrennung der Fragmente
in der Elektrophorese erfolgte ein Southern-Blot. Dieser wurde mit der YCR010c-Sonde
und anschließend mit der URA3-Sonde analysiert (Abb. 45).
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