Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

Material und Methoden
Minimalmedium für Y. lipolytica (MM)
Das Minimalmedium für Y. lipolytica setzte sich aus Salzlösung, Thiaminhydrochlorid-
Lösung, C-Quelle und bei Bedarf Supplementen zusammen.
5 x Salzlösung (5 x MMT): KH2PO4 7 g/l
K2HPO4 x 3 H2O 9,3 g/l
MgSO4 x 7 H2O 5 g/l
NH4H2PO4 25 g/l
Spurenelemente-Lösung 5 ml/l
Spurenelemente-Lösung: Ca(NO3)2 x 4 H2O 20 g/l
CoCl2 100 mg/l
CuSO4 x 5 H2O 100 mg/l
FeCl3 x 6 H2O 2 g/l
H3BO3 500 mg/l
KI 100 mg/l
MnSO4 x 4H2O 400 mg/l
NaMoO4 200 mg/l
ZnSO4 x 7 H2O 400 mg/l
1000fache Thiaminhydrochlorid-SL: Thiaminhydrochlorid 300 mg/l
steril filtrieren
Die Konzentration der C-Quellen und Supplemente sind unter der Zusammensetzung von
Minimalmedium für S. cerevisiae mit aufgeführt.
2.9 Gentechnische Arbeitsmethoden
Grundlegende gentechnische Arbeiten wurden nach Sambrook et al. (1989) und Ausubel et
al. (1997) durchgeführt.
2.9.1 Agarosegel-Elektrophorese
Die elektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten erfolgte bei 8 bis 10 V/cm in
1 x TAE-Puffer. Die Gele wurden in Abhängigkeit der zu trennenden Fragmente aus 0,5 -
2%iger Agarose und 2 µl/100 ml Ethidiumbromid-SL in 1 x TAE-Puffer hergestellt. Die DNA-
Proben wurden vor dem Auftragen mit Ladepuffer versetzt. Nach der elektrophoretischen
Auftrennung konnten entstandene DNA-Ethidiumbromidkomplexe mit einem UV-Transilluminator
bei 312 nm sichtbar gemacht werden.
50 x TAE-Puffer: EDTA (0,5 M, pH8) 100 ml/l
Eisessig 57,1 ml/l
Tris 242 g/l
Ethidiumbromid-SL: Ethidiumbromid 10 mg/ml
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