Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

Ergebnisse
Das Screening der Hefetransformanden, die auf ihrem Plasmid mutiertes Ynr002cp trugen,
ergab vier Transformanden, die nicht mehr in der Lage waren auf Medium mit Acetat zu
wachsen. Die durch Sequenzierung identifizierten veränderten Aminosäuren in Ynr002cp
sind ebenfalls in Abb. 18 dargestellt. Von diesen Transformanden enthielten drei jeweils eine
ausgetauschte Aminosäure (Tf 15: N75D, Tf 16: G147D, Tf 21: S265L). Die vierte Transformande
enthielt an drei Stellen ausgetauschte Aminosäuren (Tf 17: L74P, A87T und M268I). Die
Plasmide 16, 17 und 21 wurden aus dem Stamm DBY747 und Plasmid 15 aus
YNΔycrΔydrΔynr isoliert.
Weiterhin wurde überprüft, ob die mutierten Ycr010c- bzw. Ynr002c-Proteine einen dominanten
oder rezesiven Phänotyp aufweisen. Die Plasmide, die für diese Proteine kodierten, wur-
den in die Stämme DBY747 und YNΔycrΔydrΔynr transformiert und das Wachstum der
Transformanden auf Minimalmedium mit Essigsäure überprüft. Keine der Transformanden
war in der Lage auf Essigsäure zu wachsen, d.h. der Phänotyp aller mutierten Proteine ist
dominant.
3.3.7 C-terminale Verkürzung von Gpr1p, Ycr010cp und Ynr002cp
Augstein (2001) testete unter anderem, inwieweit die teilweise oder vollständige Deletion des
hydrophilen N-Terminus von Gpr1p Auswirkungen hat. Es zeigte sich, dass der Mutantenphänotyp
(Essigsäuresensitivität) auch auftrat, wenn der N-Terminus nahezu vollständig deletiert
wurde. Dies lässt vermuten, dass im N-Terminus keine Signalsequenzen vorkommen,
die für die korrekte Lokalisierung des Proteins wichtig sind. Daraufhin wurden die Auswirkungen
von Deletionen des ebenfalls hydrophilen C-Terminus auf das Wachstum der Transformanden
auf essigsäurehaltigem Medium getestet (siehe auch Gentsch, 2003). Der
C-Terminus von Gpr1-2p wurde unterschiedlich verkürzt (bis Aminosäure P265, Y256, A247 oder
F242). Außerdem wurde nur das YNAYA-Motiv deletiert. Diese Konstrukte wurden in die
Stämme PO1d und PO1dΔgpr1 transformiert und das Wachstum auf MMA getestet (Tab.
17). Es stellte sich u. a. heraus, dass das YNAYA-Motiv von Gpr1p wesentlich für dessen
Funktion zu sein scheint, da der Mutantenphänotyp durch Deletion von YNAYA aufgehoben
wird. Möglicherweise ist es für eine Di- bzw. Oligomerisierung des Gpr1 Proteins notwendig.
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