Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

Ammoniumsekretion in mg*ml-1*min-1
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
YN
YNDycr
YNDycr[YIp]
YNDycr[YIpYCR]
YNDycr[YIpYCR-Q75]
YNDycr[YIpYCR-D259]
Ergebnisse
Abb. 46: Ammoniumsekretion der Stämme YN und YNΔycr sowie der Transformanden des
Stammes YNΔycr. Die Stämme wurden üN in MG-Flüssigmedium kultiviert einmal
mit 1 x Readersalzen gewaschen und auf GM-Medium getropft. Nach 12 d Inkubation
bei 28 °C wurden die Zellen mit MES-Puffer gewaschen und die Ammoniumsekretion
über 25 min bestimmt.
Eine Ursache für die niedrigere Ammoniumsekretion der integrativen Transformanden könnte
darin liegen, dass in diesen Stämmen das Ycr010c-Protein nicht gebildet wurde. Dies
wurde mittels Western-Blot-Analyse überprüft (Abb. 47).
A B C D E F
2h 3h 2h 3h 2h 3h 2h 3h 2h 3h 2h 3h
Abb. 47: Expression des Ycr010c-Proteins im YN-Wildtypstamm und in den integrativen
Transformanden des Stammes YNΔycr. Die Stämme wurden üN in MG-
Flüssigmedium geschüttelt, die Zellen einmal mit 1 x Readersalzen gewaschen
und die Hauptkulturen in Minimalmedium mit Ethanol als C-Quelle überführt
(OD600 = 2). Es wurden nach 2 bzw. 3 h 50 ml Probe genommen und die Zellen
aufgeschlossen Die Analyse der Proben erfolgte im Western-Blot mit anti-HA-AK.
A) YN, B) YNΔycr, C) YNΔycr[YIp], D) YNΔycr[YIpYCR], E) YNΔycr[YIpYCR-
Q75], F) YNΔycr[YIpYCR-D259]
Abb. 47 zeigt, dass in allen integrativen Transformanden, die das YCR010c-Allel enthalten,
dieses Protein gebildet wurde. Allerdings war die Expression schwächer als im Wildtypstamm
YN.
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