Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

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Diskussion Deshalb kann eher angenommen werden, dass die Gpr1-orthologen Proteine regulatorische Funktion haben bzw. Bestandteil einer Signaltransduktionskette sind und nicht direkt am Transport von Acetat oder Ammonium beteiligt sind. 134
5 Zusammenfassung Zusammenfassung Trans-dominante Mutationen im GPR1-Gen der Hefe Y. lipolytica führen zur Sensitivität der Hefezellen gegenüber Essigsäure. Das Gpr1p-Protein ist mit seinen sechs membranspannenden Domänen in der Cytoplasmamembran lokalisiert. Die Deletionsmutante PO1dΔgpr1 zeigt gegenüber dem Wildtypstamm PO1d keine erhöhte Essigsäuresensitivität. Der Deletionsstamm PO1dΔgpr1 wies nach Transfer in Medium mit Essigsäure eine längere lag-Phase als der Wildtypstamm PO1d auf. Im N-Terminus hat das FGGTL-Motiv für die Funktion des Gpr1-Proteins eine besondere Bedeutung. Die Deletion weiterer N-terminaler Bereiche hat keinen Einfluss auf den Phänotyp von Zellen, die entsprechende Konstrukte exprimieren. Gpr1p unterliegt in Abhängigkeit von der C-Quelle im Medium einer Phosporylierung. Ziel der vorliegenden Arbeit war die funktionelle Analyse und die weiterführende Charakterisierung des Gpr1-Proteins aus Y. lipolytica und dessen Orthologen Ycr010cp, Ydr384cp und Ynr002cp von S. cerevsiae. Dabei wurden folgende Ergebnisse erzielt: • Mit Hilfe der Gewinnung von Revertanten von PO1dΔgpr1/pYLG2 bzw. PO1d-GPR1-2 sollten potentielle Interaktionspartner des Gpr1-Proteins gefunden werden. Allerdings stellte sich nach Überprüfung aller isolierten Revertantenstämme heraus, dass diese Stämme möglicherweise nur eine Veränderung des GPR1-2-Allels selbst aufwiesen. Die gewünschte Mutation in einem anderen Gen als GPR1-2 trat somit nicht auf. • Die Einzel-, Doppeldeletion oder Deletion aller drei Gpr1p-Orthologen in S. cerevisiae hatte gegenüber dem Wildtypstamm auf den getesteten C-Quellen keine Auswirkung auf die Phänotypen der Deletionsstämme. • S. cerevisiae-Transformanden, welche die Mutantenalle GPR1-1 bzw. GPR1-2 unter Kontrolle des MET25-Promotors exprimierten, zeigten bei gleichzeitiger Anwesenheit von Glucose eine erhöhte Sensitivität gegenüber Essigsäure. Die GPR1-Mutantenallele zeigten somit in der Hefe S. cerevisiae die gleiche Wirkung wie in Y. lipolytica. • Durch Ort-spezifische Mutagenese wurden in den Proteinen Ycr010c und Ynr002c analog der Aminosäureaustausche in Gpr1-1p bzw. Gpr1-2p die Aminosäuren L74 bzw. L75 durch Q und G259 durch D ausgetauscht. Transformanden, die diese veränderten Proteine unter Kontrolle des MET25-Promotors exprimierten, wiesen bei gleichzeitiger Anwesenheit von Glucose eine erhöhte Essigsäuresensitivität auf. Standen die Mutantenallele von YCR010c und YNR002c dagegen unter der Kontrolle ihres authentischen Promotors, so wurde die Sensitivität gegenüber Essigsäure in Anwesenheit von Glucose aufgeho- 135
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Funktionelle Analyse von Proteinen
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1 Einleitung 1.1 Stressantwort von
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Einleitung faktoren binden an die G
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Einleitung entgegengesetzt werden.
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Einleitung Foster (2000) stellt in
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Einleitung ATP vermieden (Braley an
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Einleitung lässt den Schluss zu, d
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Einleitung Im Glyoxylatzyklus werde
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Einleitung Die Protonenpumpe wird a
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2.6.3 Konstruierte Plasmide Tab. 4:
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2.7.3 Yarrowia lipolytica Tab. 8: V
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2.9.10 Transformation von Mikroorga
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Ergebnisse Tab. 12: Homologe Protei
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Ergebnisse Mit Hilfe verschiedener,
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3.2.3 Wachstum verschiedener Yarrow
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Ergebnisse Deshalb sollte das Wachs
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Ergebnisse Tab. 17: Wachstum von PO
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Ergebnisse In den meisten eukaryoti
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