Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

Diskussion
4.4 Ort-spezifische und zufällige Mutagenese von Gpr1p in Yarrowia lipolytica
und dessen Orthologen in Saccharomyces cerevisiae
In den Y. lipolytica-Stämmen B204-12C-38 (GPR1-3), B204-12C-112 (GPR1-1), B204-12C-
124 (GPR1-4) und B204-12C-156 (GPR1-2) führte jeweils eine Punktmutation im Gpr1-
Protein zur Essigsäuresenitivität. Dabei handelte es sich im Stamm B204-12C-112 um einen
Aminosäureaustausch im C-Terminus (G248 zu D). In den anderen Y. lipolytica-Stämmen
enthielt der N-Terminus von Gpr1p jeweils einen Aminosäureaustausch (B204-12C-12-156:
L65 zu Q, B204-12C-38: G62 zu S, B204-12C-124: G63 zu D).
Augstein (2001) analysierte die Auswirkung N-terminal deletierter Gpr1p-Konstrukte auf den
Phänotyp von PO1d- bzw. PO1dΔgpr1-Transformanden. Dabei stellte sich heraus, dass der
N-terminale Bereich bis einschließlich F60 nicht bedeutend für dessen Funktion zu sein
scheint. Die Deletion von Aminosäure F61 oder deren Mutation in Glutaminsäure bewirkt eine
Essigsäuresensitivität der Transformanden. Weitere funktionell wichtige N-terminale Bereiche
im Gpr1-Protein wurden von Gentsch (2003) analysiert. Transformanden, deren Plasmid
für NPAPLGL-deletiertes Gpr1-1p bzw. Gpr1-2p kodierte, wiesen keinen Essigsäuresensitiven
Phänotyp mehr auf.
Somit war nun von Interesse, ob der C-Terminus und insbesondere das konservierte
YNAYA-Motiv von Bedeutung für die Funktion des Gpr1-Proteins ist. Es wurden C-terminale
Deletionen durchgeführt und die Konstrukte in den Stämmen PO1d bzw. PO1dΔgpr1 expri-
miert. Dabei konnte festgestellt werden, dass gleiche C-terminal verkürzte Konstrukte unterschiedliche
Auswirkungen auf das Wachstum dieser Stämme hatten. In der Deletionsmutan-
te PO1dΔgpr1 hob bereits die Deletion bis Aminosäure P265 den negativen Effekt (Essigsäu-
resensitivität) des GPR1-2-Allels auf. PO1d-Transformanden waren erst in der Lage auf Acetat/Glucose
zu wachsen, wenn Gpr1-2p bis einschließlich des YNAYA-Motivs bzw. nur das
YNAYA-Motiv deletiert wurde. Im Wildtypstamm PO1d scheint somit das Gpr1-2p in Wechselwirkung
mit dem chromosomal kodierten Gpr1-Protein zu stehen. Dabei spielt das
YNAYA-Motiv eine entscheidende Rolle. Es wird angenommen, dass ohne dieses keine Dibzw.
Oligomerisierung mehr stattfinden kann.
In S. cerevisiae konnten nach C-terminalen Deletionen von Ycr10cp, Ycr10cp-Q75,
Ynr002cp-Q74 bzw. Ynr002cp keine Unterschiede zwischen den Stämmen YN und
YNΔycrΔydrΔynr im Wachstum auf Minimalmediumplatten mit Acetat oder Glucose als
C-Quellen festgestellt werden. Transformanden, deren Plasmid für bis Aminosäure A258 deletiertes
Ycr010cp-Q75 bzw. bis A257 deletiertes Ynr002cp-Q74 kodierte, konnten auf Acetat
als C-Quelle wachsen. Wurde nur das YNAYA-Motiv deletiert, so wurde ebenfalls die Essigsäuresensitivität
aufgehoben. Somit ist das YNAYA-Motiv in Ycr010cp bzw. Ynr002cp von
funktioneller Bedeutung. Allerdings gibt es im Gegensatz zu Gpr1p in Y. lipolytica keinen
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