Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

Einleitung
Acetat und Ethanol induzieren den Abbau von Zellorganellen der untersuchten Mutanten. Die
Mitochondrien werden am schnellsten zerstört, dagegen bleibt der Zellkern lange morphologisch
unverändert. Während des Wachstums auf Ölsäure zeigen die GPR1 d -Mutanten keine
Abnormalitäten im Vergleich zum Wildtyp, diese Zellen besitzen intakte Mitochondrien, proliferierte
Peroxisomen und die Enzyme des Glyoxylatzyklus werden normal exprimiert.
Die genetische Analyse des pleiotropen GPR1 d -Phänotyps zeigte, dass heterozygote diploide
GPR1-1/GPR1-Stämme in der Acetat- und Ethanolverwertung blockiert sind. Auf Minimalmedium
mit Glucose als C-Quelle wachsen sie dagegen normal und zeigen im Vergleich
zum Wildtypstamm keine morphologischen Veränderungen. Heterozygote GPR1-1/GPR1-2und
homozygote GPR1-1/GPR1-1-Stämme entwickeln den gleichen Phänotyp wie die haploiden
Mutantenstämme. Diese Untersuchungen zeigten, dass nur die Acetat- und Ethanolsensitivität
trans-dominant ist. Die Effekte auf Wachstumsrate, Dimorphismus und Induktion
des frühen Zelltodes sind dagegen rezessiv (Tzschoppe et al., 1999).
Sequenzanalysen von Augstein et al. (2003) ergaben, dass es sich bei der Mutation im
Stamm B204-12C-112 um einen Austausch von Glycin248 durch Asparaginsäure im C-Terminus
des Gpr1-Proteins handelte. In den Stämmen B204-12C-38, B204-12C-124 und B204-
12C-156 waren die polaren Aminosäuren Leucin65, Glycin62 bzw. Glycin63 im N-Terminus von
Gpr1p durch die polaren Aminosäuren Glutamin, Serin bzw. die saure Aminosäure Asparagin
ausgetauscht. Der GPR1-Promotor des Stammes B204-12C enthält im Gegensatz zum
GPR1-Promotor des Stammes PO1d eine Insertion des Retrotransposons Ylt1 (Augstein,
2001). Mittels Reportergenanalysen konnte festgestellt werden, dass diese Insertion eine
Erniedrigung der Expression auf 2 – 4 MU zur Folge hat. Diese minimale Genexpression hat
jedoch keine Auswirkung auf die Ausprägung des Mutantenphänotyps. Geringe Mengen an
gebildetem Gpr1p-Mutantenprotein reichen für eine Sensitivität der Zellen gegenüber Essigsäure
aus (Augstein et al., 2003).
Die Deletion von GPR1 im Stamm PO1dΔgpr1 hatte keinen phänotypischen Effekt. Ebenso
konnten durch die Überexpression des GPR1-Gens keine Auswirkungen auf den Phänotyp
beobachtet werden (Augstein, 2001).
1.3.1.2 Regulation des Promotors des GPR1-Gens
Die Untersuchung der Expression des lacZ-Reportergens unter der Kontrolle des GPR1-
Promotors ergab, dass die Transkription des GPR1-Gens durch Ethanol und Acetat im Vergleich
zu Glucose zwei- bis dreifach stärker induziert wird. Gpr1p ist aber nicht essentiell für
die Verwertung dieser C-Quellen. Die GPR1-Deletionsmutante kann in Gegenwart von Acetat
oder Ethanol selbst bei geringeren pH-Werten (pH4) normal wachsen.
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