Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

Ergebnisse
Der Nachweis der korrekten Integration des YIp352-Plasmides sowie der Konstrukte Y-
Ip352YNR, YIp352YNR-Q74 und YIpYNR-D259 in den Stamm YNΔynr erfolgte mit Hilfe der
Southern-Hybridisierung. Dazu wurde die genomische DNA des Ausgangsstammes und von
jeweils drei der Transformanden isoliert, mit EcoRV geschnitten und die Fragmente in der
Elektrophorese aufgetrennt und geblottet. Der Southern-Blot wurde mit der YNR002c- bzw.
der URA3-Sonde beprobt (Abb. 48).
Bei der Beprobung mit der YNR002c-Sonde zeigten alle Stämme eine Bande in der Größe
von ca. 10 kb, hierbei handelt es sich um die Reste der genomischen Kopie des YNR002c-
Allels. Die mit den YNR002c-Allelen transformierten Stämme wiesen eine zweite Bande der
Größe von 5,9 kb auf, diese entspricht der Größe des integrierten Vektorfragmentes. Die
Transformande YN[YIpYNR]1 wies neben den zwei zu erwartenden Banden noch weitere
auf. Wahrscheinlich war hier das Vektorfragment mehrfach integriert. Diese Transformande
wurde verworfen und nicht für weitere Untersuchungen eingesetzt. Erfolgte eine Beprobung
mit der URA3-Sonde, wurden in allen Stämmen drei verschieden große Banden detektiert. In
den transformierten Stämmen konnte eine weitere Bande in einer Größe von 5,9 kb detektiert
werden. Diese Bande stammt vom URA3-Gen des integrierten Vektors. Auch in diesem
Blot war erkennbar, dass die Transformande YN[YIpYNR]1 eine Mehrfachintegration aufwies
und nicht für weitere Versuche verwendet werden konnte.
YNR002c-Sonde URA3-Sonde
a b c d e λ-DNA
a b c d e
21226 bp
5148/ 4973 bp
4268 bp
3530 bp
2027/ 1904 bp
1584 bp
1375 bp
947 bp
Abb. 48: Southern-Blot zum Nachweis der Integration des YIp352-Plasmides sowie der
konstruierten Vektoren YIpYNR, YIpYNR-Q74 und YIpYNR-D259 in den Stamm
YNΔynr. Die genomische DNA wurde mit EcoRV geschnitten. Als Sonden wurden
das YNR002c-Fragment aus p426METYNR bzw. das URA3-Fragment aus Y-
Ip352 genutzt. Mit EcoRI/HindIII geschnittene λ-DNA diente als Größenstandard.
In den einzelnen Spuren ist die genomische DNA folgender Stämme aufgetragen:
a) YNΔynr, b) YNΔynr [YIp]1-3, c) YNΔynr[YIpYNR]1-3, d) YNΔynr [YIpYNR-
Q74]1-3, e) YNΔynr [YIpYNR-D259]1-3.
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