Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

Diskussion
chungen wurden verschiedene Membranproteine C-terminal mit His4cp fusioniert. Das Genprodukt
von HIS4C wandelt im Cytoplasma Histinol zu Histidin um. Somit sind his4cauxotrophe
Transformanden nur in der Lage auf Medium ohne Hisidin zu wachsen, wenn
sich der C-Terminus mit dem fusionierten His4cp im Cytoplasma befindet. Transformanden,
die mit His4p fusioniertes Ynr002cp exprimierten, konnten somit nicht wachsen (Kim et al.,
2003).
In der vorliegenden Arbeit konnten das Ycr010c- und das Ynr002c-Protein mittels GFP-
Fusion in der Cytoplasmamembran nachgewiesen werden. Guaragnella and Butow (2003)
lokalisierten mit GFP fusioniertes Ydr384cp in der Cytoplasmamembran. Allerdings konnte
dieses Protein ebenfalls in einer zweidimensionalen SDS-PAGE von einer mitochondrialen
Proteinfraktion nachgewiesen werden (Sickmann et al., 2003).
Mit Hilfe des ScanProsite-Programms 1 und des ELM-Servers 2 wurden potentielle Modifizierungsorte
in den Gpr1p-Orthologen von S. cerevisiae ermittelt.
In den Proteinen Ycr010cp und Ynr002cp konnte jeweils ein N-Glycosylierungsort nachgewiesen
werden. Voraussetzung für eine N-Glycosylierung ist, dass sich der
N-Glycosylierungsort in einem größeren Abstand (ca. 10 Aminosäuren) zu den membranspannenden
Domänen befindet. Weiterhin sollte der Loop, in dem sich die Glycosylierung
befindet mindestens 30 Aminosäuren groß sein (van Geest and Lolkema, 2000). Im Falle
von Ycr010cp ist dies nur in zwei der vorgeschlagenen Topologiemodelle (TMpred,
TopPred2) gegeben. Für das Ynr002c-Protein erfüllt keines der Topologiemodelle diese Voraussetzungen.
Untersuchungen dieser Arbeit haben gezeigt, dass eine Glycosylierung dieser
Proteine sehr unwahrscheinlich ist (vgl. Kapitel 3.3.12.1 und 4.6).
Weiterhin wurden sechs (Ycr010cp, Ynr002cp) bis sieben (Ydr384cp) N-Myristylierungsorte
angegeben. Voraussetzung für eine Myristylierung ist ein N-terminales Glycin, dessen Aminogruppe
bei dieser Modifizierung acetyliert wird (Towler et al., 1988; Grand, 1989). Es wurden
nur potentielle Myristylierungsstellen angezeigt, die innerhalb der Proteine liegen. Durch
eine mögliche N-terminale Prozessierung könnte ein myristylierbares Glycin zur N-terminalen
Aminosäure werden. Die Prozessierung von Ycr010cp hätte eine Verringerung des Molekulargewichtes
um 5 kDa zur Folge. Tatsächlich lief dieses Protein in der SDS-Page auf einer
Höhe von 27 kDa (theoretisch erwartete Größe: 31 kDa). Gegen eine Myristylierung spricht,
dass dieses Protein mit dem anti-Ycr010cp-Antikörper, der gegen die ersten 15 Aminosäuren
des Proteins gerichtet ist, nachgewiesen werden konnte. Im Falle von Ydr384cp kann eine
N-terminale Prozessierung nicht ausgeschlossen werden, da das mit dem HA-Tag fusionierte
Protein ein wesentlich schnelleres Laufverhalten zeigte (kleiner 26 kDa), als das theoretisch
errechnete Molekulargewicht von 33 kDa erwarten ließ. Das Protein Ynr002c müsste
um mindestens 147 Aminosäuren verkürzt werden, um ein N-terminales Glycin zu erhalten.
1 http://us.expasy.org/cgi-bin/prosite
2 http://elm.eu.org
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