Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

Ergebnisse
Abb. 24: Expression der Konstrukte von A) Ycr010cp-HA, D) Ynr002cp-HA sowie deren
Mutationen B) Ycr010cp-Q75-HA, C) Ycr010cp-D259-HA, E) Ynr002cp-Q74-HA
und F) Ynr002cp-D259-HA im Stamm YN. Die Transformanden wurden üN in
MG-Flüssigmedium geschüttelt, die Zellen einmal mit 1 x Readersalzen gewaschen
und die Hauptkulturen in Minimalmedium mit Acetat als C-Quelle (pH4)
überführt (OD600 = 2). Es wurden nach 2 bzw. 3 h 50 ml Probe genommen und die
Zellen aufgeschlossen. Die Analyse der Proben erfolgte im Western-Blot mit anti-
HA-AK. Dargestellt sind die entwickelten Western-Blots sowie die mit Ponceau-S
gefärbten PVDF-Membranen.
3.3.12 Auftreten der drei Gpr1p-Orthologen in unterschiedlichen Formen
Die Auftrennung von Zellextrakten Ycr010cp-HA, Ydr384cp-HA bzw. Ynr002cp-HA exprimierender
Zellen in der SDS-PAGE (Maxigele) ermöglichte die Separation von zwei (Ycr010cp-
HA, Ynr002cp-HA) bzw. mehreren (Ydr384cp-HA) verschieden großen Banden. Die Doppelbanden
von Ycr010cp-HA und Ynr002cp-HA liefen beide etwas schneller (bei einer Größe
von ca. 30 kDa) als ihre berechnete Größe von 34,2 kDa. Unterhalb von 26 kDa konnten die
vier Banden des Ydr384c-HA-Proteins detektiert werden. Somit lief dieses Protein ebenfalls
schneller als erwartet.
In den folgenden zwei Kapiteln sollte näher untersucht werden, ob und um welche Modifizierung
es sich bei diesen Banden handelt.
3.3.12.1 Deglycosylierung
A B C D E F
2h 3h 2h 3h 2h 3h 2h 3h 2h 3h 2h 3h
Es könnte sich bei den größeren der Banden um die glycolysierte Form des jeweiligen Proteins
handeln. Diese Möglichkeit wurde mit Hilfe der Endoglycosidase H überprüft. Nach der
Auftrennung der mit Endoglycosidase H behandelten Proben konnte kein Unterschied zu
unbehandelten Proben (Kontrollen) im Bandenmuster festgestellt werden (Daten nicht gezeigt).
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