Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

Diskussion
anderen Gen als in GPR1-2 eine Mutation, die zur Aufhebung der Essigsäure-sensitiven
Phänotyps führt. Das Genprodukt des mutierten Gens stellt somit einen potentiellen Interaktionspartner
für Gpr1p dar und sollte anschließend identifiziert werden.
Für die Gewinnung von Revertanten wurde die Transformande PO1dΔgpr1/pYLG2 eingesetzt.
Es konnten 155 Revertantenstämme isoliert werden, die in der Lage waren auf Minimalmediumplatten
mit Acetat als C-Quelle zu wachsen. Die Plasmide der meisten Transformanden
wiesen allerdings große Veränderungen im Bereich des GPR1-2 tragenden Fragmentes
auf. Die restlichen 34 Revertantenstämme besaßen zwar ein intaktes GPR1-2-
Fragment, nach Entfernung des Plasmides und erneuter Transformation mit pYLG2 waren
diese Transformanden aber nicht in der Lage auf Minimalmediumplatten mit Acetat zu wachsen.
Somit musste angenommen werden, dass die Reversionsmutation nicht chromosomal,
sondern auf dem Plasmid lokalisiert ist. Die Aufhebung des Mutantenphänotyps könnte verschiedene
Ursachen haben. Veränderungen im Promotorbereich könnten z. B. zur Folge
haben, dass das GPR1-2-Gen nicht mehr abgelesen wird und deshalb kein Gpr1-2p gebildet
wird. Somit wären Transformanden, die dieses veränderte Allel auf ihrem Plasmid tragen in
der Lage auf Minimalmedium mit Acetat als C-Quelle zu wachsen. Eine Verringerung der
Expression durch Veränderungen im Promotorbereich hätte nicht die Aufhebung des Mutantenphänotyps
zur Folge gehabt, weil bereits niedrige Mengen an mutiertem Gpr1p zur Ausbildung
des Essigsäure-sensitiven Phänotyps ausreichen (Augstein, 2001). Durch einen Austausch
oder einer Deletion von Basen des GPR1-2-Gens könnte es zur Aufhebung des negativen
Effektes des Gpr1-2-Proteins kommen. In vorhergehenden Untersuchungen konnte
gezeigt werden, dass geringfügige Veränderungen (Deletion von Aminosäuren, Fusion mit
zusätzlichen Aminosäuren) im und am C-Terminus von Gpr1-2p ausreichen, um ein Wachstum
der Transformanden auf Essigsäure zu ermöglichen. So wurde z. B. nachgewiesen,
dass der Stamm PO1d mit einem um 14 Aminosäuren verkürzten Gpr1-2p auf Minimalmedium
mit Essigsäure wachsen kann (vgl. Kapitel 3.3.7). Ähnliche Effekte wie mit mutiertem,
C-terminal deletiertem Gpr1p (Gpr1-2p) wurden durch mutiertes, C-terminal fusioniertes
Gpr1-2p hervorgerufen (Gentsch, 2003).
Aufgrund der Instabilität des verwendeten Plasmides pYLG2 wurde das GPR1-2-Allel integrativ
transformiert. Der konstruierte Stamm PO1d-GPR1-2 wurde anschließend zur Gewinnung
von Revertanten, die auf Minimalmediumplatten mit Acetat als C-Quelle wuchsen, eingesetzt.
Von den 167 isolierten und getesteten Revertanten war keine in der Lage nach
Transformation mit dem Plasmid pYLG2 (enthält das GPR1-2-Allel) auf Minimalmediumplatten
mit Acetat als C-Quelle zu wachsen. Hätte in den Revertantenstämmen eine Mutation in
einem anderen Gen als GPR1-2 zur Aufhebung der Essigsäuresensitivität geführt, so hätten
diese Transformanden in Anwesenheit von Essigsäure wachsen müssen. Möglicherweise
wurde in diesen Revertanten-Stämmen nur das enthaltene GPR1-2-Allel verändert. Diese
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