Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

Einleitung
nanten Acu - -Phänotyp zeigten, ordnete man einer zweiten Komplementationsgruppe zu.
Weitere Untersuchungen dieser Mutanten zeigten, dass alle dominanten Mutationen das
gleiche Gen betrafen. Es konnte keine Kopplung zwischen dem Gen dieser dominanten
Komplementationsgruppe und den Genen der Komplementationsgruppen ICL1, ICL2 und
ICL3 nachgewiesen werden. Das neu entdeckte Gen wurde als GPR1 (glyoxylate pathway
regulation) bezeichnet, da keine Aktivitäten der Enzyme des Glyoxylatzyklus und der ACS
während der Inkubation auf Minimalmedium mit Acetat als C-Quelle nachweisbar waren.
1.3.1.1 Charakterisierung der GPR1 d -Mutanten
Trans-dominante Mutationen im GPR1-Gen (GPR1 d ) von Y. lipolytica führen zu unterschiedlichen
pleiotropen Effekten. Es kommt zu Veränderungen intrazellulärer Strukturen, der Zellund
Koloniemorphologie sowie der Lebensspanne der Zellen. Weiterhin sind die Zellen sensitiv
gegenüber Essigsäure im Medium (Tzschoppe et al., 1999).
Die vier GPR1 d -Mutanten B204-12C-38, B204-12C-112, B204-12C-124 und B204-12C-156
wiesen die deutlichsten Veränderungen im Wachstum und der Zellmorphologie auf und wurden
deshalb näher untersucht (Tzschoppe, 1998; Tzschoppe et al., 1999). Diese Mutanten
sind selbst in Anwesenheit von Glucose sehr sensitiv gegenüber Essigsäure und Ethanol im
Medium. Nur der Stamm B204-12C-124 kann im Gegensatz zu den anderen GPR1 d -
Mutantenstämmen auf Ethanol wachsen. Im Wachstum auf Minimalmedium mit anderen
C-Quellen wie Ölsäure, Lactat oder Glycerin zeigen diese Stämme keine Wachstumsunterschiede
im Vergleich zum Wildtyp. Die GPR1 d -Mutantenstämme wachsen in Vollmedium mit
Glucose (YPD) langsamer als der Wildtyp. Weiterhin sind die Zelldichten der Mutanten in der
stationären Phase geringer als die des Wildtypstammes. Während der exponentiellen
Wachstumsphase treten bei den beiden Stämmen B204-12C-112 und B204-12C-156 verstärkt
Lyse und Zelltod auf. Weiterhin zeigen diese beiden Mutantenstämme Veränderungen
der Zellmorphologie. Im Gegensatz zum Wildtyp bildet B204-12C-112 mehr Pseudohyphen
und echte Hyphen aus, Zellen des Stammes B204-12C-156 besitzen vergrößerte Mitochondrien
und ein reduziertes endoplasmatisches Retikulum. Die Anfärbung dieser Zellen mit
dem Farbstoff FM4-64, der die Membranen von Cytoplasma, Vakuolen und endocytotischen
Vesikel färbt, zeigte, dass die intrazellulären Membranen empfindlich gegen diesen Farbstoff
sind und somit schnell zerstört werden. Dies deutet auf eine Veränderung des Elektronenpotentials
und der Zusammensetzung der Membranen hin, was durch Befunde einer veränderten
Fettsäure- und Phospholipidzusammensetzung bestätigt werden konnte. Bei den von
Tzschoppe et al. (1999) durchgeführten elektronenmikroskopischen Untersuchungen konnte
in den Mutanten keine Peroxisomenproliferation nach Umsetzung auf Minimalmedium mit
Acetat oder Ethanol als C-Quellen festgestellt werden.
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