Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

Ergebnisse
des Stammes DBY747, deren Plasmid für zufällig mutiertes Ydr384cp kodierte, getestet.
Vom Stamm YNΔycΔydrΔynr wurden dagegen nur 1200 Hefetransformanden überprüft, da
hier jede zehnte Transformande nicht mehr auf Acetat wachsen konnte, diese erwiesen sich
aber im Tropftest alle als falsch positiv. Möglicherweise haben Mutationen im Ydr384-Protein
keine Auswirkungen auf das Wachstum auf Minimalmedium mit Acetat oder es wurden zu
wenig Transformanden überprüft.
In Abb. 18 sind die Stellen der mutierten Aminosäuren in Ycr010cp und Ynr002cp, die eine
Sensitivität gegenüber Essigsäure hervorrufen, dargestellt.
Punktmutationen in YCR010c und YNR002c (random Mutagenese)
Y.l.GPR1 1 -----MNTEI PDLEKQQIDH NSG-----SD DPQPIHDDMA PVSRIRSSGP NHEYIHIADQ KFHRDDFYRA FG-GTLNPG- GAPQPSRKFG
S.c.YNR002c 1 MSDREQSSGN TAFEN-PKAL DSSEGEFISE NNDQSRHSQE SICKIYTAGK NNEYIYIGRQ KFLRDDLFEA FG-GTLNPG- LAPAPVHKFA
S.c.YCR010c 1 MSDKEQTSGN TDLENAPAGY YSSHDNDVNG VAEDERPSHD SLGKIYTGGD NNEYIYIGRQ KFLKSDLYQA FG-GTLNPG- LAPAPVHKFA
S.c.YDR384c 1 -----MTSSA SSPQDLEKGV NTLENIETLP QQGSIAGVSQ GFPNIQEIYS DRDFITLGSS TYRRRDLLNA LDRGDGEEGN CAKYTPHQFA
Consensus 1 S E S I G N EYI IG Q KF R DL A FG GTLNPG AP P HKFA
ausgetauschte AS G V V IPD T bzw.V
Y.l.GPR1 79 NPAPLGLSAF ALTTLVFSLC TVQARGVPNP SIAVGLALFY GGVCQFAAGM WEFVQENTFG AAALTSYGGF WMSWAAIEMN AFGIKDSYND
S.c.YNR002c 88 NPAPLGLSGF ALTTFVLSMF NARAQGITIP NVVVGCAMFY GGLVQLIAGI WEIALENTFG GTALCSFGGF WLSFGAIYIP WFGILDAYKD
S.c.YCR010c 89 NPAPLGLSAF ALTTFVLSMF NARAQGITVP NVVVGCAMFY GGLVQLIAGI WEIALENTFG GTALCSYGGF WLSFAAIYIP WFGILEAYED
S.c.YDR384c 86 NPVPLGLASF SLSCLVLSLI NANVRGVTDG KWALSLFMFF GGAIELFAGL LCFVIGDTYA MTVFSSFGGF WICYGYGLTD TDNLVSGYTD
Consensus 34 NPAPLGLS F ALTT VLS NA A G T P VG AMFY GG QL AG WE ENTFG TAL S GGF W S AI FGI Y D
ausgetauschte AS GD D
Y.l.GPR1 169 P-IEVQNAVG IYLFGWFIFT LMLTLCTLKS TVAFFGLFFM LMMTFLVLAC ANVTQHHGTA IGGGWLGIIT AFFGFYNAYA GLANPGNSYI
S.c.YNR002c 178 KESDLGNALG FYLLGWALFT FGLSVCTMKS TIMFFALFFL LAVTFLLLSI ANFTGEVGVT RAGGVLGVIV AFIAWYNAYA GIATRQNSYI
S.c.YCR010c 179 NESDLNNALG FYLLGWAIFT FGLTVCTMKS TVMFFLLFFL LALTFLLLSI GHFANRLGVT RAGGVLGVVV AFIAWYNAYA GVATKQNSYV
S.c.YDR384c 176 P-TMLNNVIG FFLAGWTVFT FLMLMCTLKS TWGLFLLLTF LDLTFLLLCI GTFIDNNNLK MAGGYFGILS SCCGWYSLYC SVVSPSNSYL
Consensus 90 L NA G FYL GW FT F L CT KS T FF LFF L TFLLL I F G AGG LG AF WYNAYA G A NSY
ausgetauschte AS A KS R L
Y.l.GPR1 258 VPVPLDMPFV KKD-- 270
S.c.YNR002c 268 MVHPFALPSN DKVFF 282
S.c.YCR010c 269 LARPFPLPST ERVIF 283
S.c.YDR384c 265 AFRAHTMPNA P---- 275
Consensus 141 P P 142
ausgetauschte AS I
Abb. 18: Alignment der Aminosäuresequenzen von Gpr1p, Ycr010cp, Ydr384cp und
Ynr002cp. Es wurde mit Hilfe des Programms ClustalX-1.81 (Thompson et al.,
1997) erstellt. Je nach Konservierungsgrad sind die Aminosäuren rot (identisch)
bzw. blau (hoch konserviert) dargestellt. Grau unterlegt sind die potentiell membranspannenden
Domänen, die mit dem Programm HMMTOP 1 ermittelt wurden.
Grün sind die Aminosäuren unterlegt, deren Austausch Essigsäuresensitivität
verursacht. Aminosäuren, die in Gpr1-1p bzw. Gpr1-2p ausgetauscht sind, wurden
gelb markiert.
Die zufällige Mutagenese von Ycr010cp ergab 11 Transformanden, die senstitiv gegen Essigsäure
waren. Von diesen Transformanden trugen neun eine Mutation (Tf 2 2: F212S, Tf 4:
N145D, Tf 5: E144G, Tf 6: A88V, Tf 7: T74I, Tf 11: M211K, Tf 13: F71V, Tf 16: A70V, Tf 83: E144G).
Zwei Transformanden enthielten jeweils zwei ausgetauschte Aminosäuren (Tf 35: E35G und
T209A, Tf 91: M211L und H230R). Die Plasmide, deren kodiertes Ycr010c-Protein ausgetauschte
Aminosäuren enthielt, konnten alle aus dem Stamm DBY747 isoliert werden. Unter den
Transformanden des Stammes YNΔycrΔydrΔynr konnten keine Transformanden nachgewie-
sen werden, die Essigsäure-sensitiv waren.
1 http://www.enzim.hu/hmmtop/
2 Transformande
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