Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

Ergebnisse
wiesen in dieser Größe keine Banden auf. Somit ist der anti-Ycr010c-AK spezifisch für
Ycr010cp.
3.3.15 Lokalisierung der Gpr1-Orthologen
Datenbanken sagen für die Gpr1p Orthologen Ycr010cp und Ynr002cp fünf bis sechs membranspannende
Domänen und für Ydr384cp vier bis sieben Membrandomänen voraus. Von
Interesse war nun, ob die Proteine in S. cerevisiae membranständig sind und in welcher
Membran der Zelle sie lokalisiert sind.
Die Homologen Ycr010cp, Ydr384cp und Ynr002cp wurden C-terminal mit GFP fusioniert
(vgl. Kapitel 2.9.13). Die integrativen Transformanden wurden üN in MG-Flüssigmedium geschüttelt
und die Hauptkulturen auf Minimalmedium mit Glucose, Ethanol und Acetat als
C-Quellen bzw. ohne C-Quelle angeimpft. Die Zellen wurden in regelmäßigen Abständen
licht- und fluoreszenzmikroskopisch überprüft. In Abb. 43 sind die Zellen nach 2 h Inkubation
in Minimalmedium mit Ethanol als C-Quelle dargestellt.
YN[YCR-GFP] YN[YNR-GFP]
1 2 1
2
Abb. 43: Nachweis der zellulären Lokalisation von Ycr010cp-GFP und Ynr002cp-GFP. Die
Stämme wurden üN in Minimalmedium mit Glucose kultiviert, nach dem einmaligem
Waschen mit 1 x Readersalzen wurden sie in Minimalmedium mit Ethanol
umgesetzt (OD600 = 0,2). Die mikroskopischen Aufnahmen entstanden nach
2 stündiger Kultivierung in diesem Medium. 1) fluoreszenzmikroskopische Aufnahme,
2) Interferenzkontrastmikroskopie
Im Falle des mit GFP fusionierten Ycr010cp bzw. Ynr002cp konnte nach 2stündiger Inkubation
in Minimalmedium mit Ethanol als C-Quelle eine Fluoreszenz in der Cytoplasmamembran
detektiert werden. Dies deutet auf eine Lokalisierung der beiden Proteine in der
Cytoplasmamembran hin. Für das Ydr384cp-GFP-Konstrukt konnte keine Lokalisierung
nachgewiesen werden, da keine Fluoreszenz auf den gewählten Kohlenstoffquellen beobachtet
werden konnte. Bei einer Kultivierung von Hefetransformanden, die Ydr384cp-HA
exprimierten, konnte in Minimalmedium mit Ethanol, Acetat oder ohne C-Quelle in Western-
Blots eine Proteinexpression detektiert werden (vgl. Kapitel 3.3.13.2). Somit hätte das
Ydr384cp-GFP-Fusionsprotein nachgewiesen werden müssen. Möglicherweise war die Ex-
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