Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

Einleitung
Im Vergleich zu Minimalmedium ohne C-Quelle wird der GPR1-Promotor durch Medium mit
Ölsäure, Glucose und am stärksten durch Glycerol reprimiert. Die Kultivierung auf Minimalmedium
mit Acetat, Ethanol, Lactat, oder Pyruvat als C-Quellen führt zu einer Derepression
des Gens. Auf Mischmedien mit Glucose ist erst nach Glucoseverbrauch eine erhöhte Promotoraktivität
messbar. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der GPR1-Promotor eher
durch Derepression als durch Induktion reguliert wird (Augstein, 2001).
Von Augstein (2001) durchgeführte Promotorstudien (Deletion von Promotorbereichen und
anschließende lacZ-Fusion mit Bestimmung der β-Galaktosidseaktivität, Gel-Shift-Experi-
mente) zeigten, dass ein Bereich, der zwei überlappende potentielle Motive für Transkriptionsfaktoren
enthält, einen starken Einfluss auf die Promotoraktivität hat. Bei diesen Motiven
handelt es sich um das CSRE-Motiv (carbon source responsive element) aus S. cerevisiae
sowie das FACB-Bindemotiv aus Aspergillus nidulans. An diese Motive binden in S. cerevisiae
Cat8p/Sip4p bzw. FacBp in A. nidulans. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein
ähnliches Regulatorprotein an der Regulation von GPR1 beteiligt sein könnte. Allerdings gibt
es in Y. lipolytica kein Cat8p homologes Protein (Barth, persönliche Mitteilung). Es ist jedoch
nicht auszuschließen, dass z. B. das FacBp-Orthologe in Y. lipolytica dessen Funktion übernimmt.
1.3.1.3 N-terminale Deletionen des Gpr1-Proteins
Im Gegensatz zu Gpr1p-Orthologen in Prokaryoten besitzen die Vertreter in Eukaryoten einen
hydrophilen N-Terminus. Drei der vier untersuchten GPR1-Mutantenallele haben in diesem
Bereich Aminosäureaustausche, die den Mutantenphänotyp verursachen. Es konnten
im N-Terminus keine Signalsequenzen für eine Membranlokalisierung des Proteins identifiziert
werden. Für eine weitere Aufklärung der Funktion des N-terminalen Bereichs wurde
dieser teilweise deletiert und mutiert.
Der N-Terminus bis einschließlich F60 ist nicht essentiell für die Funktion des Gpr1-Proteins.
Wird der N-Terminus vollständig oder teilweise bis einschließlich F61 deletiert, so sind Transformanden
mit diesem Konstrukt Essigsäure-sensitiv. Die alleinige Deletion der Aminosäure
F61 oder deren Mutation in Glutaminsäure bewirkt ebenfalls eine Sensitivität der Transformanden
gegenüber Essigsäure. Das Ersetzen dieser Aminosäure durch Tyrosin, das strukturell
ähnlich ist, hat dagegen keinen Einfluss auf das Wachstum der Transformanden auf Medium
mit Essigsäure (Augstein, 2001; Augstein et al., 2003).
Gentsch (2003) führte weitere Deletionsanalysen des Gpr1-Proteins durch. Hierbei wurde
das Familienmotiv NPAPLG als funktionell wichtiger Bereich identifiziert.
1.3.1.4 Lokalisierung des Gpr1-Proteins
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