Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

Diskussion
kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass ein anderes Protein dessen Funktion übernimmt.
In den Promotorregionen von YCR010c und YNR002c konnten Bindemotive für den
Transkriptionsfaktor StuAp aus A. nidulans identifiziert werden. Die Hefe S. cerevisiae besitzt
in Sok2p einen Transkriptionsfaktor mit signifikanter Homologie zu StuAp (Ward et al., 1995).
Das Sok2-Protein ist als negativer Regulator an der Entwicklung von Pseudohyphen beteiligt,
(Ward et al., 1995; Pan and Heitman, 2000). Vachova et al. (2004) beobachteten, dass
die Deletion von SOK2 eine niedrigere Expression der GPR1-Orthologen zur Folge hatte.
Obwohl Bindemotive für Abf1p und Mcm1p in den Promotorregionen von YDR384c bzw.
YNR002c nachgewiesen wurden, ist nicht anzunehmen, dass diese Transkriptionsfaktoren
an der Regulation beteiligt sind. Beide Transkriptionsfaktoren sind an Prozessen im Kern
bzw. der Replikation von Minichromosomen involviert (Marahrens and Stillman, 1992; Chang
et al., 2003; Miyake et al., 2004). Bisher gibt es keinen Hinweis auf eine Lokalisierung der
GPR1-Orthologen im Zellkern oder deren Beteiligung an diesen Prozessen.
4.6 Auftreten der drei Gpr1p-Orthologen in unterschiedlichen Formen
Bei der Auftrennung von Zellextrakten, die Ycr010cp-HA, Ydr384cp-HA bzw. Ynr002cp-HA
exprimierten, konnten zwei (Ycr10cp-HA, Ynr002cp-HA) bzw. mehrere (Ydr384cp-HA) verschieden
große Banden detektiert werden. Mit Hilfe des ScanProsite-Programms 1 wurden in
alle Proteinen potentielle Phosphorylierungsorte identifiziert. Die Proteine Ycr010cp und
Ynr002cp enthalten weiterhin jeweils einen möglichen Glycosylierungsort. Das Auftreten von
Doppelbanden könnte durch solche Modifizierungen erklärbar sein. Es wurde experimentell
unter Verwendung der Endoglucosidase H, die an verzweigten Mannose-Strukturen angreift,
überprüft, ob eine Glycosylierung der Proteine vorlag. Die Untersuchungen haben gezeigt,
dass nach dem Einwirken von Endoglucosidase H keine Veränderung des Molekulargewichtes
der Proteine auftrat. Somit können mögliche Modifizierungen der Proteine nicht auf eine
Glycosylierung zurückgeführt werden.
Dagegen konnte festgestellt werden, dass Ynr002cp einer Phosphorylierung unterliegt. Es
müssten weitere Experimente zur Identifizierung des Phosphorylierungsortes durchgeführt
werden. Dies könnte durch Ort-spezifische Mutagenese potentieller Phosphorylierungsstellen
und daran anschließender Überprüfung des Phosphorylierungsstatus erfolgen. Weiterhin
müsste abgeklärt werden, unter welchen Bedingungen diese Phosphorylierung auftritt. Diese
Versuche könnten weiteren Aufschluss über eine mögliche Funktion von Ynr002cp geben.
Bei elektrophoretischen Untersuchungen des mit dem HA-Tag fusionierten Ycr010cp konnte
eine Doppelbande detektiert werden. Mit Hilfe des anti-Ycr010c-Antikörpers konnte gezeigt
1 http://us.expasy.org/cgi-bin/prosite
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