Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

3.3.12.2 Dephosphorylierung
Ergebnisse
Weiterhin wäre es möglich, dass Ycr010cp-HA, Ydr384cp-HA und Ynr002cp-HA phosphory-
liert werden. Um dies zu überprüfen wurden die entsprechenden Zellextrakte mit λ-Protein-
Phosphatase behandelt. Als Positivkontrolle wurde PO1d/pTSC1-HA mitgeführt. Diese
Transformande kodierte für Gpr1p-HA. Die Analyse fand mit Hilfe eines Western-Blots statt,
der in Abb. 25 dargestellt ist.
Ycr010cp-HA Ydr384cp-HA Ynr002cp-HA Gpr1p-HA
a b c d a b c d a b c d a b c d
Abb. 25: Behandlung von Ycr010cp-HA, Ydr384cp-HA und Ynr002cp-HA mit λ-PPase.
Gpr1p-HA aus der Hefe Y. lipolytica diente als Positivkontrolle. Die Kultivierung
der Transformanden des Stammes YN erfolgte in Minimalmedium mit Ethanol als
C-Quelle, die Zellen wurden nach 2 h bis 3 h geerntet. Der Stamm PO1d/pTSC1-
HA wurde üN in MMG-Medium geschüttelt und die Zellen in frisches MMG-
Flüssigmedium überführt. Nach 2 bis 4 h Kultivierung wurde 30 mM Acetat zugegeben,
die Zellen nach 2 h weiterer Kultivierung geerntet und aufgeschlossen. Die
Analyse der Proben erfolgte im Western-Blot mit anti-HA-AK. In den Spuren sind
folgende Ansätze aufgetragen: a) Proteinextrakt eingefroren, b) Proteinextrakt bei
30 °C inkubiert, c) Dephosphorylierungsansatz mit λ-PPase, d) Dephosphorylierungsansatz
ohne λ-PPase.
Der Kontrollansatz von Gpr1p-HA zeigte, dass Gpr1p-HA zum Teil in phosphorylierter Form
vorlag, die höhermolekulare Bande verschwand nach Zugabe von λ-PPase im Dephosphory-
lierungsansatz. Wurde im Dephosphorylierungsansatz keine λ-PPase zugegeben, so kam es
nicht zur Umwandlung der höhermolekularen Bande.
Im Falle von Ycr010cp-HA und Ydr384cp-HA konnte nach Behandlung mit λ-PPase keine
Veränderung im Bandenmuster festgestellt werden. Wurde der Ynr002cp-HA enthaltende
Proteinextrakt mit λ-PPase behandelt, so verschwand die höhermolekulare Bande. Somit ist
diese höhermolekulare Bande von Ycr010cp durch eine Phosphorylierung des Proteins be-
dingt. Nach Zugabe von Puffer und MnCl2 (Kofaktor der λ-PPase) kam es ebenfalls fast zur
vollständigen Umwandlung der höhermolekularen Form. In diesem Ansatz wurden offensichtlich
zelluläre Phosphatasen aktiviert, die das Ynr002c-Protein dephosphorylierten.
Für das Ycr10c-Protein konnte keine Modifizierung durch Phosphorylierung nachgewiesen
werden. Es sollte somit überprüft werden, ob es sich bei den beiden mit dem anti-HA-AK
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