Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

Material und Methoden
Die RNA-Konzentration und –Reinheit wurde mittels Absorptionsmessung bei OD260 und
OD280 ermittelt (OD260:OD280 sollte ca. 2 betragen, 1 OD260 = 40 ng/µl). In allen Proben wurde
die RNA-Konzentration auf 3 µg/µl eingestellt und die Proben bei -20 °C aufbewahrt.
Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1): Phenol pH4,2 (SIGMA P-4682)
Extraktionspuffer: EDTA 1 mM
LiCl 100 mM
SDS 1 % (w/v)
Tris-HCl (pH7,5) 100 mM
2.9.9 Northern-Hybridisierung
Elektrophorese und Kapillarblot
Für das Agarosegel wurde 1 % (w/v) Agarose in 1 x NBC gelöst. Nachdem die Gellösung auf
60 °C abgekühlt war, wurde 37%iges Formaldehyd (2 ml pro 80 ml) zugegeben und die Lösung
in die Gel-Apparatur gegossen. Zur Equilibrierung des Gels und Zerstörung vorhandener
RNasen fand ein 15minütiger Vorlauf statt.
Zu 2,5 µl RNA-Lösung (3 µg/µl) wurden 8,5 µl Ladepuffer II zugegeben und die Proben 5 min
bei 70 °C denaturiert, danach wurden diese sofort für 5 min auf Eis abgekühlt. Die RNA-
Proben wurden auf das Gel aufgetragen und bei 10 V/cm aufgetrennt. Zur Entfernung des
Formaldehyds im Gel wurde dies anschließend 2 x 10 min mit dH2O gewaschen. Danach
erfolgte eine 10minütige Inkubation des Gels in 10 x SSC. Der Transfer der RNA auf die Hybond-N+
(Amersham Biosciences) erfolgte üN mittels Kappilarblotting unter Verwendung von
10 x SSC. Nachdem die Membran in 2 x SSC gewaschen wurde, erfolgte die Fixierung der
RNA mittels UV-Crosslinking (2 x 125 mJoule).
Prähybridisierung und Hybridisierung
Die Prähybridisierung erfolgte in Hybridisierungspuffer für 2 h bei 65 °C. In dieser Zeit wurden
die Sonden mit Hilfe des „Megaprime TM DNA labelling systems“ (Amersham Biosciences)
nach Angaben des Herstellers markiert. Für die Markierung der Sonden wurde die DNA
mittels PCR gewonnen (Tab. 9). Die markierte Sonden-DNA wurde über eine Säule (NICK
columns der Firma Amersham Biosciences) gereinigt und die Radioaktivität bestimmt. Es
wurden von der markierten Sonden-DNA 1 Million cpm für die Hybridisierung eingesetzt. Die
markierte Sonde wurde 5 min bei 100 °C denaturiert und anschließend auf Eis abgekühlt.
Nach der Zugabe der Sonde erfolgte die Hybridisierung bei 65 °C üN im Hybridisierungsofen.
39