Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

3.3.9 Untersuchung der Nit2p-Erkennungssequenz
Ergebnisse
Mit Hilfe des Programms MatInspector V2.2 1 konnten in den Promotoren der drei GPR1-
Orthologen YCR010c, YDR384c und YNR002c verschiedene Erkennungssequenzen für
Regulatorproteine identifiziert werden (vgl. Kapitel 3.3.8). Darunter befanden sich in allen
drei Promotoren Sequenzmotive die mögliche Bindungsstellen für das Nit2p aus N. crassa
(Gln3p in S. cerevisiae) darstellen. In N. crassa werden nach dem Verbrauch von primären
Stickstoffquellen Strukturgene durch Nit2p aktiviert, die für die Verwertung sekundärer Stickstoffverbindungen
benötigt werden (Chiang et al., 1994; Chiang and Marzluf, 1995).
Microarray-Daten, die in der SGD 2 zugänglich sind, zeigen eine Repression von YDR384c
unter Stickstofflimitation (Tab. 19). YNR002c wird unter diesen Bedingungen induziert. Die
Regulation von YCR010c ist dagegen unabhängig von der Stickstoffquelle. Dillschneider
(2003) untersuchte in ihrer Diplomarbeit die Funktionalität der möglichen Nit2p-Bindungsstellen
im Promotor von YNR002c. Die für Nit2p möglichen Bindungsstellen mit dem Sequenzmotiv
GATA wurden zu TATA mutiert. Anschließend wurde die Aktivität der
β-Galactosidase unter Kontrolle des unveränderten und des mutierten YNR002c-Promotors
(YNR002c-NIT2-4) auf verschiedenen Stickstoffquellen in Minimalmedium mit Ethanol als
C-Quelle bestimmt. Als primäre Stickstoffquellen wurden Ammoniumsulfat und Glutamat
verwendet, Prolin kam als sekundäre Stickstoffquelle zum Einsatz. Die Zunahmen der
β-Galactosidaseaktivitäten sind in Abb. 22 dargestellt.
Zunhame der β-
Galaktosidaseaktivität in MU/h
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
YN[YIp357RYNRPr] YN[YIp357RYNRPr-
NIT2-4]
Ammoniumsulfat
Glutamat
Prolin
Abb. 22: Zunahme der β-Galacosidaseaktivität unter Kontrolle des YNR002c- und
YNR002c-NIT2-4-Promotors in Abhängigkeit von verschiedenen N-Quellen über
einen Kultivierungszeitraum von 10 h (nach Dillschneider, 2003).
1 http://www.genomatix.de
2 http://www.yeastgenome.org/
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