Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

Material und Methoden
500 ml YPD-Medium wurden mit einer üN-Kultur des gewünschten Hefestammes mit einer
OD600 von ca. 0,3 angeimpft. Es erfolgte die Kultivierung bei 28 °C auf dem Schüttler bis zum
Erreichen einer OD600 von 1,3 bis 1,5. Die Zellen wurden bei 4000 x g für 5 min und 4 °C
geerntet. Das Pellet wurde zweimal mit eiskaltem dH2O (500 ml bzw. 250 ml) gewaschen
und danach in 20 ml eiskaltem 1 M Sorbitol aufgenommen. Nach erneuter Zentrifugation
wurden die Zellen in 0,5 ml 1 M Sorbitol resuspendiert (Endvolumen ca. 1,5 ml) und in Portionen
von 40 µl mit Trockeneis/Ethanol schockgefroren. Die Lagerung der Zellen erfolgte bei
-80 °C.
Zur Transformation wurden 40 µl elektrokompetente Hefezellen mit 100 bis 400 ng Plasmid-
DNA gemischt, in eine Elektroporationsküvette (0,2 cm von PeqLab, vorgekühlt) überführt
und einem elektrischen Puls von 1,8 kV bei 200 Ω und 25 µF ausgesetzt. Die Zellen wurden
anschließend sofort in 1 ml Sorbitol aufgenommen und auf Selektivagarplatten ausplattiert.
Nach 2 bis 3 Tagen Kultivierung bei 28 °C wurden die Transformanden sichtbar.
2.9.10.4 Integrative Transformation von Yarrowia lipolytica
Die integrative Transformation von Y. lipolytica erfolgte nach der bei Barth and Gaillardin
(1996) beschriebenen Methode. Die Selektion der Transformanden erfolgte auf MMG-Platten
unter Zusatz von 5-FOA (1,25 g/l) und Uracil (10 mg/l).
Es wurden 500 ng Fragment-DNA für die Transformation verwendet.
2.9.11 DNA-Sequenzierung
Die korrekte Sequenz aller Konstrukte wurde durch DNA-Sequenzierung nach der Kettenabbruchmethode
von Sanger et al. (1977) mit Hilfe des Sequenzierers CEQ TM 2000XL der Firma
Beckman Coulter unter Verwendung des Kitsystems „CEQ TM DTSC-Quickstart“ überprüft.
2.9.12 Southern-Hybridisierung
Für Southern-Hybridisierungen wurden das „Gene Images random prime labelling module“
und das „Gene Images CDP-Star detection module“ der Firma Amersham Biosciences verwendet
und nach den Herstellerangaben verfahren.
Es wurden 500 ng geschnittene genomische DNA sowie 5 ng λDNA (EcoRI/HindIII geschnit-
ten) als Größenstandard aufgetragen.
Die verwendeten Sonden und deren Herstellung sind in Tab. 10 angegeben.
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