Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

Zusammenfassung
ben. Der Mutantenphänotyp wurde nur ausgeprägt, wenn Acetat allein als C-Quelle zur
Verfügung stand.
• Mittels C-terminaler Verkürzungen bzw. Deletionen von Gpr1p und dessen Orthologen
Ycr010cp bzw. Ynr002cp in S. cervisiae konnte in allen Proteinen das YNAYA-Motiv als
funktionell wichtig identifiziert werden.
• Zur Aufklärung weiterer funktionell wichtiger Bereiche, die in Gpr1p noch nicht bekannt
waren, wurde eine zufällige Mutagenese mit den Gpr1p-Orthologen von S. cerevisiae
durchgeführt. Die Transformanden wurden auf Sensitivität gegenüber Essigsäure selektiert.
Es konnten 11 Transformanden isoliert werden, deren Ycr010c-Protein Aminosäureaustausche
enthielt. Das Screening von mutiertem YNR002c ergab vier Transformanden.
Alle Aminosäureaustausche in Ycr010cp bzw. Ynr002cp haben einen dominanten
Mutantenphänotyp zur Folge. Im Falle des Ydr383cp konnten keine Transformanden mit
einem Essigsäure-sensitiven Phänotyp isoliert werden. Möglicherweise verursachen
Aminosäureaustausche in diesem Protein keinen solchen Phänotyp.
• Die Regulation der GPR1-Orthologen in Abhängigkeit von der zur Verfügung stehenden
C-Quelle wurde mit Hilfe des LacZ-Reportergens, Northern- und Western-Blots untersucht.
Dabei konnte eine Abhängigkeit der Regulation von der C-Quelle festgestellt werden.
YCR010c und YNR002c werden durch Ethanol stark induziert, YDR384c dagegen
reprimiert. Ebenso erfolgt durch Glycerol eine Induktion von YCR010c. Im Gegensatz zu
GPR1 der Hefe Y. lipolytica werden alle drei Orthologen nur schwach durch Acetat und
Lactat induziert. In Anwesenheit von Glucose werden alle drei Homologen unterschiedlich
exprimiert. Ycr010cp wird nicht und Ynr002cp nur in sehr geringen Mengen,
Ydr384cp dagegen bis zum Beginn der exponentiellen Phase gebildet. Nach Glucoseverbrauch
ist die Expression aller drei Gene hoch.
Es konnte nachgewiesen werden, dass die Erkennungssequenzen für Nit2p im 5´-upstream-Bereich
von YNR002c funktionell sind.
Die Expression der Homologen YCR010c und YDR384c wird durch allgemeinen Stress
induziert.
Die Gpr1p-Orthologen werden voneinander unabhängig reguliert.
• Die Expression der Gpr1p-Orthologen ist unabhängig vom pH-Wert des Mediums. Erhöhte
Konzentrationen an Essigsäure im Kulturmedium haben eine geringere Expression aller
drei Homologen zur Folge.
• S. cerevisiae ist nicht in der Lage bei einer Konzentration von 50 mM Essigsäure (pH4)
im Medium zu wachsen. Steht den Zellen neben Essigsäure gleichzeitig Glucose zur Ver-
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