Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

Diskussion
werden, dass diese Banden eindeutig dem Ycr010c-Protein zuzuordnen sind. Allerdings war
es überraschend, dass Ycr010cp ohne HA-Tag keine Doppelbanden ausbildet, sondern im
Gel nur eine Bande nachweisbar war. Es ist nicht auszuschließen, dass diese Einzelbande
eine vollständig modifizierte Form des Ycr010c-Proteins ist und eine Fusion mit dem HA-Tag
diese vollständige Modifizierung beeinflusst bzw. verhindert. Ein ähnliches Phänomen wurde
ebenfalls für Gpr1p in Y. lipolytica beobachtet. Das Gpr1-Protein wird nach Zugabe von Acetat
zum Medium vollständig phosphoryliert (Gentsch and Barth, 2005). Dagegen wird ein mit
dem HA-Tag fusioniertes Gpr1p nur noch teilweise durch die Zugabe von Acetat modifiziert
und es kommt zum Auftreten von Doppelbanden (Gentsch, persönliche Mitteilung).
4.7 Expression in Minimalmedium mit verschiedenen Essigsäurekonzentrationen
In Vorversuchen wurde festgestellt, dass die Expression der Gpr1p-Orthologen in Minimalmedium
mit Acetat als C-Quelle unterschiedlich hoch war. Je niedriger der pH-Wert war,
desto geringer war auch die Expression der drei Homologen. Enthielt das Minimalmedium
Glucose, Ethanol oder keine C-Quelle, so hatte der pH-Wert keinen Einfluss auf die Expressionsstärke.
Diese Beobachtungen ließen den Schluss zu, dass nur die Konzentration an
Essigsäure und nicht der pH-Wert des Mediums für die unterschiedlichen Expressionsstärken
verantwortlich war. Es konnte in einem weiteren Versuch festgestellt werden, dass die
Expression der Gpr1p-Orthologen unterschiedlich durch die im Minimalmedium vorhandene
Essigsäure beeinflusst wurde. Die Expression von Ycr010cp-HA verringerte sich mit steigender
Essigsäurekonzentration am stärksten. Ab einer Konzentration von 15 mM Essigsäure
fand eine deutlich geringere Expression statt. Die Expressionsänderungen von Ydr384cp-HA
und Ynr002cp-HA waren dagegen weniger stark. Hier nahmen die Expressionsstärken erst
ab 30 mM Essigsäure im Minimalmedium ab. Betrug die Konzentration an Essigsäure im
Minimalmedium 50 mM, so konnte keine Expression der Homologen mehr nachgewiesen
werden. Dies lag vermutlich daran, dass diese Konzentration für die Zellen toxisch war.
In einem Tropfplattentest wurde die Toxizität verschiedener Essigsäurekonzentrationen auf
Hefezellen überprüft. Enthielt das Minimalmedium 50 mM Essigsäure, waren die Zellen nicht
mehr in der Lage zu wachsen. Stand jedoch neben Essigsäure noch Glucose als C-Quelle
zur Verfügung, so war diese Acetatkonzentration nicht mehr toxisch. Glucose stellt für die
Hefezellen eine zusätzliche Energiequelle dar. Mit Hilfe dieser Energiereserven könnten sie
in der Lage sein, durch zelluläre Prozesse den toxischen Effekt von Essigsäure zu verhindern.
Möglicherweise weist die ATPase in zusätzlicher Gegenwart von Glucose eine höhere
Aktivität auf, und es können mehr Protonen aus der Zelle ausgeschleust werden. Somit
könnten weitaus höhere Essigsäurekonzentrationen toleriert werden. Es ist allerdings nicht
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