Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

Material und Methoden
mer YCR-Spe-uni und YCR-D259-rev verwendet. Die Amplifizierung des PCR-Fragmentes
erfolgte mit dem Plasmid p426METYCR als Template. Das entstandene PCR-Produkt wurde
über SpeI und EcoRI in den Vektor p426METYCR kloniert (p246METYCR-D259).
Die Ort-spezifischen Mutagenesen von L74 zu Q und G259 zu D in Ynr002cp wurden ebenfalls
mit Hilfe der OEP (vgl. Kapitel 2.9.4) durchgeführt. Zur Klonierung von p426METYNR-Q74
wurden zuerst die Subfragmente mit den Primern YNR-Spe-uni/YNR-237-rev bzw. YNR-237uni/YNR-Cla-rev
und p426METYNR als Template erzeugt. Diese PCR-Fragmente wurden in
der folgenden PCR als Template und YNR-Spe-uni/YNR-Cla-rev als Primer verwendet. Das
entstandene PCR-Produkt wurde über SpeI und ClaI in den Vektor p426METYNR kloniert.
Für den Austausch von G259 zu D fand ebenfalls eine Amplifikation von zwei Subfragmenten
statt. Dabei dienten YNR-Spe-uni/YNR-792-rev sowie YNR-775-uni/YNR-Cla-rev als Primer
und p426METYNR als Template. Anschließend wurden diese Subfragmente in einer weiteren
PCR als Template verwendet. Die eingesetzten Primer waren YNR-Spe-uni und YNR-
Cla-rev. Das PCR-Produkt wurde über SpeI und ClaI in p426METYNR (p426METYNR-
D259) kloniert.
Zufällige Mutagenese der Allele YCR010c, YDR384c und YNR002c
Nach Shafikhani et al. (1997) wurde eine mutagene PCR mit Taq-Polymerase in Gegenwart
von 0,05, 0,1 und 0,15 mM MnCl2 unter der Verwendung der Primer YCR-Spe-uni/YCR-Clarev,
YDR-Spe-uni/YDR-Cla-rev sowie YNR-Spe-uni/YNR-Cla-rev durchgeführt. Als Template
dienten die Plasmide p426METYCR, p426METYDR bzw. p426METYNR. Die entstandenen
PCR-Produkte wurden über SpeI/ClaI in den Vektor p426MET25 kloniert. Der resultierende
Plasmidpool wurde in E. coli transformiert, jeweils von ca. 12 Kolonien Plasmid-DNA präpariert
und die Inserts sequenziert. Zur Transformation in die Stämme DBY747 und
YNΔycrΔydrΔynr wurde der Ansatz gewählt, dessen Inserts die meisten Einzelmutationen
aufwies. Die Hefetransformanden wurden auf frische MG-Platten ausgestrichen und an-
schließend auf MA- (nur der Stamm YNΔycrΔydrΔynr), MAG- und MG-Platten überstempelt.
Von Transformanden, die ein schlechteres Wachstum auf MA bzw. MAG zeigten wurden
1 x 10 5 Zellen auf MA-, MAG- und MG-Platten ausgetropft und somit nochmals deren
Wachstum überprüft. Konnte der Phänotyp bestätigt werden, erfolgte eine Plasmid-
Reisolierung und Transformation der Plasmid-DNA in E. coli. Aus jeweils drei E. coli-
Transformanden wurde die Plasmid-DNA präpariert und anschließend zur Identifizierung der
Mutationen zwei der Inserts sequenziert.
Klonierung der Allele YCR010c, YDR384c und YNR002c
Die Amplifizierung des YCR010c-, YDR384c- und YNR002c-Allels fand mit Hilfe der Primer
YCRPr-Hindf/YCR-Cla-rev, YDRPr-Sac-uni/YDR-Cla-rev bzw. YNRPr-Sac-uni/YNR-Cla-rev
44