Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

Material und Methoden
Es wurden 4%ige Sammelgele und 12%ige Trenngele verwendet. In Tab. 11 ist das Pipettierschema
für 15 ml einer 12%igen Trenngellösung bzw. 10 ml einer 4%igen Sammelgellösung
angegeben.
Zuerst wurde das Trenngel gegossen und mit Isopropanol überschichtet. Nach dessen Polymerisation
wurde das Isopropanol abgeschüttet und mit dH2O nachgespült. Anschließend
wurde das Sammelgel gegossen und der Probenkamm eingesetzt. Nach der Polymerisation
des Sammelgels wurde die Elektrophoreseapparatur zusammengesetzt, mit 1 x Elektrodenpuffer
gefüllt und die Probenkämme entfernt. Vor dem Auftragen der Proteinlösung wurden
die Probentaschen mit 1 x Elektrodenpuffer gespült. Die Elektrophorese erfolgte bei 20 mA
(Sammelgel) und 30 mA (Trenngel). Die Auftrennung der Deglycosylierungs- bzw.
Dephosphorylierungsansätze erfolgte im Maxigel Gelelektrophorese-System von Biometra
bei einer Stromstärke von 30 mA pro Gel für das Sammelgel und 55 mA pro Gel für das
Trenngel. Dieses Gel wurde während der Elektrophorese gekühlt (4 °C).
10 x Elektrodenpuffer: Glycin 1,92 M
SDS 1 % (w/v)
Tris 250 mM
6 x Probenpuffer: Bromphenolblau 0,012 %
DTT 200 mM, frisch zugeben
Glycerol 36 % (v/v)
SDS 10,28 % (w/v)
Tris-HCl (pH6,8) 0,35 M
Tab. 11: Zusammensetzung der Gellösungen (Menge ausreichend für 2 Minigele) für die
SDS-PAGE. Für andere Gelvolumina wurde ein entsprechendes Vielfaches aller
Volumina verwendet.
Lösung Trenngel Sammelgel Stammlösungen
(12 %)
(4 %)
Acrylamid-Lösung 6 ml 1,3 ml 30 % (w/v) Acrylamid, 0,8 % (w/v) Bisacryl-
amid
4 x Trenngelpuffer 3,75 ml - 1,5 M Tris-HCl, pH8,8
4 Sammelgelpuffer - 2,5 ml 0,5 M Tris-HCl, pH6,8
SDS-Lösung 150 µl 100 µl 10 % (w/v) SDS
TEMED 7,5 µl 10 µl unverdünnt
APS-Lösung 75 µl 50 µl 10 % (w/v) Ammoniumperoxodisulfat
dH2O 5 ml 6,04 ml
Gesamtvolumen 15 ml 10 ml
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