Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

Diskussion
len für Adapter-Protein-Komplexe. Einige der Yxxphi-Motive befinden sich in den drei Homologen
in Membrandomänen, von funktioneller Bedeutung können jedoch nur jene in den cytoplasmatischen
Bereichen sein. Im Ycr010c-Protein liegt eins dieser Motive im hydrophilen
N-Terminus, Ydr384cp enthält ein Yxxphi-Motiv im C-terminalen Teil. Jeweils eins dieser
Motive ist im N- bzw. C-Terminus von Ynr002cp lokalisiert.
Im Ydr384c-Protein konnten außerdem ein Cyclin-Erkennungsort (RxL-Motiv), eine Erkennungssequenz
für 14-3-3-Proteine sowie eine WW-Domäne (Klasse IV) identifiziert werden.
Der Cyclin-Erkennungsort (RxL) ist in vielen Cyclin/CDK (cyclin dependent kinase) interagierenden
Proteinen enthalten (Takeda et al., 2001; Lowe et al., 2002). Proteine der 14-3-3-
Familie sind in allen eukaryotischen Organismen präsent. Sie sind an wichtigen zellulären
Prozessen wie der Signaltransduktion, Regulation des Zellzyklus, Apoptose und Stressantwort
beteiligt (Liu et al., 1997; Zhang et al., 1997; Brunet et al., 1999; Cacace et al., 1999;
Hausser et al., 1999; Zhou et al., 1999). Die WW-Domäne besteht aus etwa 38 bis 40 Aminosäuren
und vermittelt über die Bindung kurzer Prolin-reicher Regionen Protein-Protein-
Interaktionen. Die Unterteilung der WW-Domänen erfolgt nach ihrer Spezifität zu Liganden in
vier Klassen (Kato et al., 2002). Proteine, die WW-Domänen enthalten, sind z. B. in der
Signaltransduktion oder der Regulation der Mitose involviert (Lu et al., 1999; Myers et al.,
2001; Sudol et al., 2001; Morris et al., 1999).
Es konnten verschiedene potentielle Modifizierungs- und Interaktionsstellen in den Gpr1p-
Orthologen von S. cerevisiae mittels Datenbanken identifiziert werden. Auffällig ist, dass es
verschiedene Hinweise auf eine mögliche Beteiligung dieser Proteine in einer Signaltransduktionskette
gibt. Zurzeit kann jedoch keine Aussage getroffen werden, ob eines dieser
Motive eine biologische Aktivität besitzt.
4.2 Identifizierung möglicher Interaktionspartner von Gpr1p
Bisherige Befunde zum dominanten Phänotyp der Mutantenallele GPR1-1 und GPR1-2 in
Y. lipolytica sind ein Hinweis auf eine mögliche Interaktion von Gpr1p mit anderen Proteinen.
Möglicherweise ist das Gpr1-Protein in einer Signaltransduktionskette der Hefe involviert.
Somit stellte sich die Frage, wie potentielle Interaktionspartner gefunden werden können. Da
verschiedene Methoden nicht zum gewünschten Erfolg führten (vgl. Kapitel 3.2.1; Gentsch,
2003), sollte dies mit Hilfe der Gewinnung von Revertanten-Stämmen erreicht werden. Die
Isolierung der Revertanten-Stämme erfolgte über ihren Phänotyp. Dabei wurde sich auf eins
der GPR1-Mutantenallele (GPR1-2) konzentriert. Transformanden bzw. Stämme, die das
Gpr1-2-Mutantenprotein enthielten, wurden auf Minimalmediumplatten mit Acetat ausplattiert.
Hefen, die Gpr1-2p exprimieren, sind normalerweise nicht in der Lage auf diesem Medium
zu wachsen. Stämme die dennoch wachsen können, besitzen möglicherweise in einem
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