Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

Ergebnisse
tiert. Deshalb wurde zuerst eine PCR mit den Primern TSB1-d32/GPR-LacZ mit ganzen
E. coli-Zellen durchgeführt, deren Produkt eine Aussage darüber zuließ, ob das GPR1-2tragende
Fragment noch enthalten war. Von E. coli-Kolonien, deren Plasmid ein PCR-
Produkt ergab, wurde das Plasmid präpariert, mittels Restriktionsverdau mit EcoRV überprüft
und nochmals in PO1dΔgpr1 transformiert. Das Wachstum der Transformanden wurde auf
Minimalmediumplatten mit Acetat getestet. Parallel dazu wurden die Revertanten, damit sie
ihr Plasmid verlieren, in YPD kultiviert und danach erneut mit pYLG2 transformiert und ihr
Wachstum ebenfalls auf Minimalmediumplatten mit Acetat überprüft.
Konnte durch beide Tests bestätigt werden, dass es sich um eine Mutation im Genom handelt,
so sollte von den entsprechenden Stämmen eine Genbank hergestellt werden. Anschließend
sollten die erhaltenen Genbanken in Y. lipolytica-Stämme, die GPR1-1 bzw.
GPR1-2 integrativ in ihrem Genom besitzen, transformiert werden.
Insgesamt wurden 155 Revertanten isoliert. Davon wiesen die Plasmide von 115 dieser Revertanten
große Veränderungen auf, d. h. sie ergaben kein PCR-Produkt bzw. die Banden
waren im Restriktionsverdau verändert (die Bande des GPR1-2 tragenden Fragmentes konnte
nicht mehr nachgewiesen werden). Nach erneuter Transformation mit dem Plasmid
pYLG2 konnten alle Transformanden nicht mehr auf Minimalmedium mit Acetat wachsen.
Somit konnten mit dieser Vorgehensweise keine Revertanten isoliert werden, die den Phänotyp
von GPR1-2 aufheben konnten. Eine mögliche Ursache hierfür ist die Instabilität des
verwendeten Plasmids pYLG2, deshalb sollte das GPR1-2-Allel integrativ in PO1dΔgpr1
transformiert werden.
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