Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

Material und Methoden
Klonierung der Vektoren zur integrativen Transformation der YCR010c- und YNR002c-
Allele
Die Klonierung der YCR010c-Allele in YIp352 erfolgte in zwei Schritten. Zuerst wurde der
CYC1-Terminator aus p426MET25 in YIp352 kloniert, dies erfolgte über die Restriktionsschnittstellen
SalI und KpnI (YIp352CYC1). Die YCR010c-Allele wurden mit Hilfe der Primer
YCRPr-Sph-uni/YCR-Xho-rev sowie p416YCR, p416YCR-Q75 bzw. p416YCR-D259 als
Template amplifiziert. Die entstandenen PCR-Produkte wurden mit SphI und XhoI geschnitten
und in den Vektor YIp352CYC1 kloniert (YIpYCR, YIpYCR-Q75, YIpYCR-D259).
Für die Klonierung der YNR002c-Allele in den integrativen Vektor YIp352 wurden dieser und
die Plasmide p416YNR, p416YNR-Q74 sowie p416YNR-D259 mit den Restriktionsenzymen
SacI und KpnI geschnitten. Anschließend erfolgte die Ligation der YNR002c-Fragmente mit
dem Vektor YIp352 (YIpYNR, YIpYNR-Q74, YIpYNR-D259).
2.9.14 Konstruktion des Yarrowia-lipolytica-Stammes PO1d-GPR1-2
Bei dieser Konstruktion wurde als Ausgangsstamm PO1dΔgpr1 gewählt. Der Stamm wurde
integrativ mit dem GPR1-2-Fragment, das durch das Schneiden des Vektors pYLG2 mit den
Restriktionsenzymen BamHI/HindIII gewonnen wurde, transformiert. Die entstandenen
Transformanden wurden auf MG-Platten mit 5-FOA (Endkonzentration: 1,25 mg/ml) selektiert.
Nach der weiteren Überprüfung des Phänotyps auf MA-Platten erfolgte im Southern-
Blot die Kontrolle des Genotyps.
2.10 Biochemische Methoden
2.10.1 Zellaufschluss mittels Glasperlen
Von einer Zellkultur wurden 50 ml (entsprach 35 bis 100 OD600) durch eine 5minütige Zentrifugation
bei 3000 x g und 4 °C geerntet. Das Zellpellet wurde mit 1 ml eiskaltem Aufschlusspuffer
gewaschen und bei -80 °C eingefroren. Zu den gefrorenen Zellpellets wurden 500 µl
Aufschlusspuffer mit Complete TM und ca. 0,3 g Glasperlen (Ø 0,45 mm) zugegeben. Der Aufschluss
erfolgte bei 4 °C in der Zellmühle bei 30 Hz für 4 min. Die Zelltrümmer wurden
10 min bei 4 °C und 3000 x g abzentrifugiert und der Überstand in ein neues Eppendorf-
Reaktionsgefäß überführt.
Aufschlusspuffer: Sorbitol 0,4 M
Tris-HCl, pH7,5 50 mM
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