Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

Material und Methoden
GFP-Fusionskonstrukte
Um eine zelluläre Lokalisierung der Gpr1p-Orthologen zu ermöglichen sollten diese C-terminal
mit GFP fusioniert werden. Für die PCR wurde das Plasmid pUG30 als Template und die
Primer YCR-GFP-uni/YCRt-kan-rev, YDR-GFP-uni/YDRt-kan–rev sowie YNR-GFPuni/YNRt-kan-rev
verwendet. Es wurden mit Hilfe dieser PCR das GFP- und das Kanamycin-
Gen (kodiert für Resistenz gegen Gentamycin) amplifiziert. Die Primer enthielten an ihren
Enden Sequenzen des jeweiligen Homologen, so dass eine integrative Transformation der
PCR-Produkte über diese Sequenzen in die Hefe S. cervisiae erfolgen konnte. Die Selektion
der Transformanden erfolgte auf YPD-Platten mit zugesetztem Gentamycin (Endkonzentartion:
200 mg/l).
HA-Fusionskonstrukte
Für die C-terminale Fusion von Ycr010cp und Ynr002cp mit 3 x HA waren OEPs (vgl. Kapitel
2.9.4) notwendig.
Zunächst fand die Amplifizierung der Subfragmente mit den Primern sYCR-uni/YCR-849-rev
bzw. YCR-HA-uni/HAStopp-Cla-rev unter Verwendung von p416YCR bzw. YEp351-3HA als
jeweiliges Template statt. Die sich anschließende PCR wurde mit den beiden Subfragmenten
und den Primern sYCR-uni/HAStopp-Cla-rev durchgeführt. Die Klonierung des entstandenen
PCR-Fragmentes konnte über die Schnittstellen HindIII und ClaI in die Vektoren p416YCR
(p416YCR-HA), p416YCR-Q75 (p416YCR-Q75-HA) und p416YCR-D259 (p416YCR-D259-
HA) erfolgen.
Zur Klonierung der C-terminalen Fusion von Ydr384cp mit 3 x HA wurden zuerst PCRs mit
den Primern sYDRPr-f2/YDR-825-rev bzw. YDR-HA-uni/HA-Stopp-Hind-rev und p416YDR
bzw. YEp351-3HA als Templates durchgeführt. Die beiden Fragmente wurden in der folgenden
PCR als Template sowie sYDRPr-f2/HAStopp-Cla-rev als Primer genutzt. Das erhaltene
PCR-Fragment konnte über XbaI und HindIII in den Vektor p416YDR (p416YDR-HA) kloniert
werden.
Zur C-terminalen Fusion von Ynr002cp mit 3 x HA mussten ebenfalls Subfragmente amplifiziert
werden. Die PCR fand mit Hilfe der Primer sYNR-uni/YNR-846-rev bzw. YNR-HAuni/HAStopp-Cla-rev
sowie p416YNR bzw. YEp351-3HA als Templates statt. Beide Subfragmente
dienten in der folgenden PCR als Template, es wurden die Primer sYNRuni/HAStopp-Cla-rev
verwendet. Das entstandene PCR-Fragment wurde über die Schnittstellen
HindIII und ClaI in die Vektoren p416YNR (p416YNR-HA), p416YNR-Q74 (p416YNR-
Q74-HA) und p416YNR-D259 (p416YNR-D259-HA) kloniert.
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