Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

2.10.2 Proteinbestimmung nach Lowry et al. (1951)
Material und Methoden
Die Proben wurden je nach Bedarf mit 0,1 M NaOH verdünnt. Zu 0,2 ml Probe wurden 1 ml
Lösung D gegeben und nach gutem Durchmischen für mindestens 10 min bei RT stehen
gelassen. Danach wurden 100 µl Lösung E zugegeben und sofort kräftig geschüttelt. Nach
30 min konnte die Extinktion der Proben bei λ = 720 nm (d = 1 cm) gegen einen Leerwert
(0,1 M NaOH) gemessen werden. Die Bestimmung des Proteingehalts erfolgte durch den
Abgleich mit einer Standardeichkurve, die nach den gleichen Vorgaben unter Verwendung
von jeweils 0,02 µg, 0,04 µg, 0,06 µg, 0,08 µg und 0,1 µg BSA angefertigt wurde.
Lösung A: 2 % (w/v) Na2CO3 in 0,1 NaOH
Lösung B: 1 % (w/v) CuSO4 x 5H2O
Lösung C: 2 % (w/v) Na-K-Tartrat
Lösung D: 49 ml Lösung A mit 0,5 ml Lösung B und 0,5 ml Lösung C mischen
Lösung E: 1 N Folin-Ciocalteau-Reagenz
2.10.3 Deglycosylierung
Es wurden 80 bis 100 µg Gesamtprotein mit EndoH-Puffer und 5 mU Endoglycosidase H
versetzt. Der Reaktionsansatz wurde eine Stunde bei 37 °C inkubiert. Nach 10minütiger Inkubation
bei 40 °C mit Probenpuffer (vgl. Kapitel 2.10.5) wurden die Proben mittels SDS-
PAGE aufgetrennt und im Western-Blot analysiert.
2 x EndoH-Puffer: Natriumcitrat (pH5,5) 150 mM
β-Mercaptoethanol 100 mM
2.10.4 Dephosphorylierung
Zur Dephosphorylierung wurden 80 bis 100 µg Gesamtprotein eingesetzt. Die Dephosphory-
lierungsreaktion fand im mitgelieferten Puffer und mit 400 U λ-Protein-Phosphatase in einem
Gesamtvolumen von 20 µl bei 37 °C für 1 h statt. Die Proben wurden anschließend 10 Minuten
in Probenpuffer (vgl. Kapitel 2.10.5) bei 40 °C inkubiert. Danach erfolgte die Auftrennung
und Analyse der Proteinproben mittels SDS-PAGE sowie Western-Blot.
2.10.5 SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE)
Zur elektrophoretischen Auftrennung von Proteinen unter denaturierenden Bedingungen
wurde nach der Methode der diskontinuierlichen Elektrophorese nach Laemmli (1970) verfahren.
Die aufgetragene Proteinmenge betrug 45 µg, im Falle einer vorangegangen Deglycosylierung
bzw. Dephosphorylierung 80 bis 100 µg.
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