Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

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Diskussion
In der vorliegenden Arbeit wurde die Charakterisierung des Gpr1-Proteins der Hefe Y. lipolytica
und dessen drei Orthologen in S. cerevisiae durchgeführt. Dabei war die Identifizierung
funktionell wichtiger Bereiche des C-terminalen Teils des Gpr1-Proteins von besonderem
Interesse. Erste Untersuchungen wurden zur Identifikation möglicher Interaktionspartner von
Gpr1p durchgeführt. Die funktionelle Analyse des Gpr1-Proteins wurde dadurch erschwert,
dass fünf weitere homologe Proteine in Y. lipolytica vorhanden sind. S. cerevisiae wurde in
die Untersuchungen mit einbezogen, weil diese Hefe nur drei Gpr1p-Orhologe (Ycr010cp,
Ydr384cp und Ynr002cp) enthält und Mutantenstämme mit Deletionen von ein, zwei oder
allen drei dieser Gene verfügbar waren. Im Mittelpunkt stand die Bestimmung der Regulation
dieser drei GPR1-orthologen Gene mit Hilfe von LacZ als Reportergen sowie Northern- und
Western-Blots. Weiterhin stand die Identifizierung funktionell wichtiger Bereiche dieser Proteine
im Vordergrund der Arbeiten. Zusätzlich wurde die Auswirkung von Doppeldeletionen
oder Deletion aller drei Homologen auf die Ammoniumsekretion dieser Deletionsstämme
überprüft.
4.1 Datenbankanalyse von Gpr1p und dessen Orthologen in Saccharomyces
cerevisiae
Die zur Verfügung stehenden Programme zur Vorhersage der Topologie berechnen für die
Gpr1p-Orthologen vier bis sieben membranspannende Domänen. Der überwiegende Teil
dieser Programme geht von sechs Membrandomänen aus. Dabei wird eine unterschiedliche
Orientierung des Proteins in der Membran angegeben, N- und C-Terminus sind entweder
extrazellulär oder cytoplasmatisch lokalisiert. Bisherige Befunde in Y. lipolytica sprechen dafür,
dass sich der N-Terminus sowie der zweite Loop von Gpr1p auf der cytoplasmatischen
Seite, der erste und dritte Loop dagegen auf der extrazellulären Seite der Cytoplasmamembran
befinden. Der ORF eines artifiziellen Phytochelatins wurde in diesen Versuchen
hinter die erste, zweite und dritte membranspannende Domäne von Gpr1p kloniert. Phytochelatine
können die Schwermetalltoleranz erhöhen, indem sie Metallionen wie z. B. Silber
und Cadmium binden. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass Transformanden,
die das artifizielle Phytochelatin hinter der ersten und dritten Membrandomäne von Gpr1p
exprimierten, extrazellulär Silber binden konnten. Dazu waren Transformanden, die das artifizielle
Phytochelatin nach der zweiten Membrandomänen exprimierten nicht in der Lage
(Bär, persönliche Mitteilung). Im Gegensatz dazu wiesen Kim et al. (2003) nach, dass der N-
und C-Terminus von Ynr002cp an der extrazellulären Seite lokalisiert ist. In diesen Untersu-
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