Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

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Zusammenfassung
Trans-dominante Mutationen im GPR1-Gen der Hefe Y. lipolytica führen zur Sensitivität der
Hefezellen gegenüber Essigsäure. Das Gpr1p-Protein ist mit seinen sechs membranspannenden
Domänen in der Cytoplasmamembran lokalisiert. Die Deletionsmutante
PO1dΔgpr1 zeigt gegenüber dem Wildtypstamm PO1d keine erhöhte Essigsäuresensitivität.
Der Deletionsstamm PO1dΔgpr1 wies nach Transfer in Medium mit Essigsäure eine längere
lag-Phase als der Wildtypstamm PO1d auf. Im N-Terminus hat das FGGTL-Motiv für die
Funktion des Gpr1-Proteins eine besondere Bedeutung. Die Deletion weiterer N-terminaler
Bereiche hat keinen Einfluss auf den Phänotyp von Zellen, die entsprechende Konstrukte
exprimieren. Gpr1p unterliegt in Abhängigkeit von der C-Quelle im Medium einer Phosporylierung.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die funktionelle Analyse und die weiterführende Charakterisierung
des Gpr1-Proteins aus Y. lipolytica und dessen Orthologen Ycr010cp, Ydr384cp und
Ynr002cp von S. cerevsiae. Dabei wurden folgende Ergebnisse erzielt:
• Mit Hilfe der Gewinnung von Revertanten von PO1dΔgpr1/pYLG2 bzw. PO1d-GPR1-2
sollten potentielle Interaktionspartner des Gpr1-Proteins gefunden werden. Allerdings
stellte sich nach Überprüfung aller isolierten Revertantenstämme heraus, dass diese
Stämme möglicherweise nur eine Veränderung des GPR1-2-Allels selbst aufwiesen. Die
gewünschte Mutation in einem anderen Gen als GPR1-2 trat somit nicht auf.
• Die Einzel-, Doppeldeletion oder Deletion aller drei Gpr1p-Orthologen in S. cerevisiae
hatte gegenüber dem Wildtypstamm auf den getesteten C-Quellen keine Auswirkung auf
die Phänotypen der Deletionsstämme.
• S. cerevisiae-Transformanden, welche die Mutantenalle GPR1-1 bzw. GPR1-2 unter
Kontrolle des MET25-Promotors exprimierten, zeigten bei gleichzeitiger Anwesenheit von
Glucose eine erhöhte Sensitivität gegenüber Essigsäure. Die GPR1-Mutantenallele zeigten
somit in der Hefe S. cerevisiae die gleiche Wirkung wie in Y. lipolytica.
• Durch Ort-spezifische Mutagenese wurden in den Proteinen Ycr010c und Ynr002c analog
der Aminosäureaustausche in Gpr1-1p bzw. Gpr1-2p die Aminosäuren L74 bzw. L75
durch Q und G259 durch D ausgetauscht. Transformanden, die diese veränderten Proteine
unter Kontrolle des MET25-Promotors exprimierten, wiesen bei gleichzeitiger Anwesenheit
von Glucose eine erhöhte Essigsäuresensitivität auf. Standen die Mutantenallele
von YCR010c und YNR002c dagegen unter der Kontrolle ihres authentischen Promotors,
so wurde die Sensitivität gegenüber Essigsäure in Anwesenheit von Glucose aufgeho-
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