Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

Ergebnisse
rung an den Tagen 90 und 120 statt. Diese Seren wurden ebenfalls im Western-Blot auf den
vorhandenen Ycr010c-AK getestet (Abb. 39, Abb. 40 und Abb. 41).
Nach 91 Tagen wurde das Serum von Kaninchen 1 und der sekundäre Antikörper in verschiedenen
Verdünnungsstufen eingesetzt, um die optimale Verdünnung der Antikörper zu
ermitteln (Abb. 39).
1:50000 1:10000 1:5000
sekundärer AK
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 primärer AK
a b a b a b a b a b a b a b a b a b a b a b a b Stamm
Ycr10cp
Abb. 39: Test verschiedener Verdünnungen der primären bzw. sekundären AK unter Verwendung
des Serums von Kaninchen 1 (nach 90 Tagen). Die Stämme a) YN und
b) YNΔycrΔydrΔynr wurden üN in MG-Flüssigmedium geschüttelt. Die Vorkulturen
wurden einmal mit 1 x Readersalzen gewaschen und in Minimalmedium mit Ethanol
als C-Quelle überführt. Nach 2 h wurden die Zellen geerntet, aufgeschlossen
und die Zellextrakte im Western-Blot analysiert. Der primäre AK (anti-YCR-AK)
wurde in den Verdünnungen 1) 1:500, 2) 1:1000, 3) 1:2500 bzw. 4) 1:5000 und
der sekundäre AK in den Verhältnissen 1:50000, 1:10000 bzw. 1:5000 eingesetzt.
Die optimale Verdünnung des primären anti-YCR-AK war 1:2500. Der sekundäre AK konnte
in einer Verdünnung von 1:5000 oder 1:10000 eingesetzt werden.
In einem weiteren Versuch wurden die Seren aller drei Kaninchen getestet. Das Ergebnis
des Western-Blots ist in Abb. 40 dargestellt.
Der Western-Blot zeigte, dass der sekundäre AK bei der Verwendung der Seren von Kaninchen
1 und 3 in einer Verdünnung von 1:5000 eingesetzt werden sollte. Wurde dagegen als
primärer AK das Serum von Kaninchen 2 genutzt, so war eine Verdünnung des sekundären
AK von 1:10000 optimal. Die wenigsten Nebenbanden traten bei der Verwendung des Serums
von Kaninchen 1 auf.
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