Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

6 x Ladepuffer: Bromphenolblau 0,05 % (w/v)
Glycerol 30 % (v/v)
Tris, 1 % (w/v) 1 Tropfen
2.9.2 Restriktionsspaltungen
Material und Methoden
Für präparative Restriktionsspaltungen wurde die benötigte Menge an Plasmid-DNA bzw.
PCR-Produkt mit 3 U Enzym pro µg DNA sowie dem für das Enzym optimalen Puffer versetzt
und 3 h oder üN bei 37 °C inkubiert. Analytische Restriktionsanalysen erfolgten in einem
Gesamtvolumen von 10 µl mit ca. 500 ng DNA, dem entsprechenden Puffer und 0,2 U
Enzym bei 37 °C für 1 h.
2.9.3 Ligation von DNA-Fragmenten
Die Vektor-DNA wurde mit Insert-DNA im molaren Verhältnis von 1:3 gemischt und nach
Zugabe von Ligasepuffer und T4-Ligase (3 U) in einem Endvolumen von 20 µl 3 h bei Raumtemperatur
oder üN bei 16 °C ligiert.
Vor der Transformation in E. coli wurden 4 µl des Ligationsansatzes mit Hilfe einer „Milipore
White VSWP Membrane“ (Ø 0,025 µm) 15 min gegen dH2O dialysiert.
2.9.4 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
Die Amplifikation von DNA-Fragmenten erfolgte in einer zweistufigen PCR, wobei die Annealingtemperatur
der ersten 5 Zyklen 6 °C und die der folgenden 20 Zyklen je 3 °C unter der
Schmelztemperatur (TS) des Primers mit der niedrigsten Schmelztemperatur lag.
Die PCR wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
Initialschmelzen 94 °C 5 min
5 Zyklen Schmelzen 94 °C 1 min
Annealing TS-6 °C 1 min 30 s
Synthese 72 °C 1 min pro 1000 bp
20 Zyklen Schmelzen 94 °C 1 min
Annealing TS-3 °C 1 min 30 s
Synthese 72 °C 1 min pro 1000 bp
Synthese 72 °C 5-7 min
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