Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

4.5 Sequenzanalyse und Regulation der Promotoren der GPR1-
Orthologen
Diskussion
Hinweise auf die mögliche Funktion von Proteinen können durch die Analyse der Promotoren
ihrer Gene erhalten werden. Deshalb wurden die Promotorbereiche der GPR1-orthologen
Gene YCR010c, YDR384c und YNR002c mit Hilfe des MatInspectorV2.2 1 auf potentielle
Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren analysiert. Weiterhin wurde die Expression dieser
homologen Gene mit Hilfe des LacZ-Reportergens, Northern-Blots und Western-Blot-
Analysen während der Kultivierung der verschiedenen YN-Stämme und deren Transformanden
auf Minimalmedium mit unterschiedlichen C-Quellen untersucht.
Es wurden verschiedene Transkriptionsfaktoren identifiziert, die auf eine Glucose-abhängige
Regulation schließen lassen. Die Promotoren von YCR010c und YNR002c enthalten eine
Bindungsstelle für Mig1p. Dieser Transkriptionsfaktor ist für die Repression Glucosereprimierbarer
Gene zuständig (Nehlin and Ronne, 1990; Lundin et al., 1994; Lutfiyya et al.,
1998). In den Promotoren aller drei Gene konnten Bindungsstellen für Gcr1p nachgewiesen
werden. Allerdings sind diese potentiellen Bindungsstellen wahrscheinlich nicht funktionell,
da der Transkriptionsfaktor Gcr1p für die positive Regulation glycolytischer Gene zuständig
ist (Holland et al., 1987; Willis et al., 2003). Ycr010cp wird nicht und Ynr002cp nur sehr
schwach in Anwesenheit von Glucose im Minimalmedium gebildet. Das Ydr384c-Protein wird
bis zum Beginn der exponentiellen Phase exprimiert. Zu diesem Zeitpunkt ist jedoch davon
auszugehen, dass im Kulturmedium noch viel Glucose vorhanden ist, die in der Glycolyse
verwertet werden könnte. Weiterhin werden alle drei Gene erst nach Glucoseverbrauch sehr
stark exprimiert. Haurie et al. (2001) stellten fest, dass YCR010c, das in seinem Promotor
ein CSRE-Motiv enthält, durch Cat8p positiv reguliert wird. YNR002c unterliegt dagegen einer
negativen Regulation von Cat8p. Unabhängig von Cat8p wird YDR384c reguliert (Haurie
et al., 2001). Dies konnte in den durchgeführten Expressionsanalysen bestätigt werden. Die
maximale β-Galactosidaseaktivität betrug unter der Kontrolle der Promotoren von YDR384c
und YNR002c auf Minimalmedium mit Glucose als C-Quelle etwa 20 MU. Stand das LacZ-
Gen unter der Kontrolle von YCR010c, so konnte keine β-Galactosidaseaktivität nachgewie-
sen werden. Diese Ergebnisse konnten ebenfalls im Northern-Blot und in den Western-Blot-
Analysen bestätigt werden. Während der Kultivierung auf Minimalmedium mit Glucose als
C-Quelle waren weder die RNA noch das Protein von YCR010c nachweisbar. Zum Zeitpunkt
von 24 h konnten sie allerdings detektiert werden. Die Expression von YNR002c war, außer
nach 24 h (hier trat eine starke Expression auf), über den gesamten Kultivierungszeitraum (0
bis 24 h) nur sehr schwach. Interessanterweise wurde YDR384c bis zu einem Zeitpunkt von
ca. sechs bis acht Stunden exprimiert. Mit dem Beginn der exponentiellen Wachstumsphase
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