Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

Einleitung
Im Glyoxylatzyklus werden Zwei-Kohlenstoff-Acetyleinheiten in Vier-Kohlenstoff-Acetyleinheiten
(Succinat) umgewandelt. Dabei umgeht der Glyoxylatzyklus die beiden Decarboxylierungsschritte
des Citratzyklus. Ein weiterer Unterschied besteht darin, dass zwei Moleküle
Acetyl-CoA pro Durchgang eingeschleust werden, während es beim Citratzyklus nur ein Molekül
ist. Der Glyoxylatzyklus beginnt wie der Citratzyklus mit der Kondensation von Acetyl-
CoA und Oxalacetat zu Citrat, das im folgenden Schritt zu Isocitrat isomerisiert wird. Anschließend
erfolgt anstatt der Decarboxylierung die Spaltung des Isocitrats in Succinat und
Glyoxylat durch die Isocitratlyase. In den folgenden Schritten wird Oxalacetat aus Glyoxylat
regeneriert. Acetyl-CoA kondensiert mit Glyoxylat zu Malat, dies wird durch die Malat-
Synthase katalysiert. Danach wird Malat zu Oxalacetat oxidiert.
1.3 Die Gpr1/Fun34/yaaH-Proteinfamilie
Mitglieder der Gpr1/Fun34/yaaH-Familie besitzen die konservierten Sequenzmotive
(A/G)NPAPLGL und SYG(X)FW, sowie 5 bis 6 membranspannende Domänen. Die Gene
dieser Proteinfamilie codieren für hochkonservierte Proteine, die sowohl in Archae- und Eubakterien
als auch in niederen eukaryotischen Zellen vorkommen. Die Proteine der Prokaryoten
besitzen im Gegensatz zu den eukaryotischen Vertretern keinen hydrophilen
N-Terminus.
1.3.1 Das GPR1-Gen der Hefe Yarrowia lipolytica
Mutanten der Hefe Y. lipolytica, die in der Acetatverwertung blockiert sind, wurden von mehreren
Arbeitsgruppen isoliert und charakterisiert (Matsuoka et al., 1980; Matsuoka et al.,
1984; Bassel and Mortimer, 1982; Barth, 1985; Barth and Weber, 1987). Kujau et al. (1992)
mutagenisierten die Y. lipolytica Stämme B204-12C und KB50-4 mit N-Methyl-N´-Nitro-N-
Nitroso-Guanidin. Es konnten 550 Acetat-nichtverwertende (Acu - ) Mutanten durch Replikaplattierung
von Minimalmedium mit Glucose auf Minimalmedium mit Acetat selektiert werden.
Diese Mutanten konnten in 4 phänotypische Klassen (Klasse I bis IV) eingeteilt werden.
Die Charakterisierung basierte auf der Verwertung von Acetat, Ethanol und n-Alkanen. Weiterhin
wurden in den Mutanten die Enzymaktivitäten der Acetyl-CoA Synthetase (ACS), der
Isocitratlyase (ICL) und der Malatsynthase (MAS) gemessen.
Mutanten der Klasse II zeigten kein Wachstum auf Ethanol und Acetat, konnten aber n-Alkane
als C-Quelle verwerten. Der Komplementationsgruppe ICL2 wurden wurden 92 Mutanten
zugeordnet, bei denen keine oder kaum eine ACS-Aktivität nachgewiesen werden konnte.
Sieben Mutanten des Stammes B204-12C und eine des Stammes KB50-4, die einen domi-
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