Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

3.3.4 Ort-spezifische Mutagenese von Ycr010cp und Ynr002cp
Ergebnisse
Die Gpr1p-Orthologen Ycr010cp und Ynr002cp besitzen 47 % identische Aminosäuren zu
Gpr1p, Ydr384cp enthält dagegen 27 % identische Aminosäuren. Diese hohen Homologien
der Proteine lassen ähnliche oder gleiche Funktionen vermuten. Um diesen Sachverhalt zu
testen, sollten Ort-spezifische Mutationen analog zu denen im Gpr1-Protein (Gpr1-1p und
Gpr1-2p) in die Orthologen eingeführt werden. Ycr010cp und Ynr002cp enthalten an den
Stellen L74 (Ynr002cp) bzw. L75 (Ycr010cp) und G259 die gleichen Aminosäuren wie Gpr1p,
Ydr384cp enthält dagegen an diesen Stellen andere Aminosäuren (E72 und S255) (vgl. Abb.
5). Im N-Terminus befindet sich somit anstatt einer hydrophoben Aminosäure (Leucin) eine
saure Aminosäure (Glutaminsäure). Der C-Terminus von Ydr384cp enthält an der Stelle 255
die Aminosäure Serin, die wie Glycin eine polare Aminosäure ist. Allerdings sind in Ydr384cp
die an Serin angrenzenden Aminosäuren völlig verschieden von denen in Gpr1p, Ycr010cp
oder Ynr002cp (Ydr384cp enthält z. B. kein YNAYA-Motiv wie die anderen Proteine). Somit
kamen für diese Mutagenese nur Ycr010cp und Ynr002cp in Frage. Es wurden im N-
Terminus Leucin in Glutamin (AS 75 in Ycr010cp, AS 74 in Ynr002cp) und im C-Terminus
Glycin gegen Asparaginsäure (AS 259) ausgetauscht. Die Expression der mutierten Proteine
erfolgte im Vektor p426MET25. Das Wachstum der Transformanden wurde in einem Tropftest
überprüft (Tab. 15).
Tab. 15: Wachstum von YN- und YNΔycrΔydrΔynr-Transformanden, deren Plasmide für
Ycr010cp und Ynr002cp sowie deren Mutantenproteine mit AS-Austauschen kodieren.
Die Transformanden wurden üN in MG-Flüssigmedium geschüttelt, von diesen
Kulturen wurden 1 x 10 5 Zellen auf die entsprechenden Agarplatten getropft. Die
Platten wurden bei 28 °C inkubiert. Es bedeuten „+++“, dass diese Transformanden
genauso gut wie Transformanden mit p426METYCR bzw. p426METYNR wuchsen.
Konnte kein Wachstum festgestellt werden, ist dies durch „-“ gekennzeichnet.
Plasmid Glucose Acetat/Glucose
YN YNΔycrΔydrΔynr YN YNΔycrΔydrΔynr
p426METYCR +++ +++ +++ +++
p426METYCR-Q75 +++ +++ - -
p426METYCR-D259 +++ +++ - -
p426METYNR +++ +++ +++ +++
p426METYNR-Q74 +++ +++ - -
p426METYNR-D259 +++ +++ - -
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