Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...
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Material und Methoden<br />
Tab. 10: Herstellung <strong>der</strong> Sonden, die für die Southern-Hybridisierung verwendet wurden.<br />
Sonde Plasmid Herstellung <strong>der</strong> Sonde<br />
YCR010c p426METYCR SpeI/ClaI-Fragment (859bp)<br />
YNR002c p426METYNR SpeI/ClaI-Fragment (856bp)<br />
URA3 (S.c.) YIp352 NdeI/Mph1103I-Fragment (903bp)<br />
GPR1 pUCGlacZF EcoRV/BamHI-Fragment (845bp)<br />
URA3 (Y.l.) pINA443 SalI-Fragment (1704 bp)<br />
2.9.13 Plasmidkonstruktionen<br />
In den Anlagen befinden sich Plasmidkarten wichtiger Plasmide.<br />
Plasmide, die für verschiedene <strong>Gpr1</strong>-Proteine kodieren<br />
Die Amplifizierung <strong>der</strong> GPR1-Allele (GPR1, GPR1-1 und GPR1-2) erfolgte mit Hilfe <strong>der</strong> Primer<br />
GPR1-Spe-uni/GPR1-Cla-rev unter Verwendung <strong>der</strong> Plasmide pYLG1, pYLG2 bzw.<br />
pYLG3 als entsprechende Templates. Die PCR-Produkte wurden über die Schnittstellen<br />
SpeI und ClaI in den Vektor p426MET25 kloniert (p426MET-GPR1, p426METGPR1-1 und<br />
p426METGPR1-2).<br />
Plasmide mit den GPR1-Orthologen aus S. cerevisiae<br />
Die Amplifizierung <strong>der</strong> GPR1-Orthologen YCR010c, YDR384c bzw. YNR002c fand unter<br />
Verwendung <strong>der</strong> Primerpaare YCR-Spe-uni/YCR-Cla-rev, YDR-Spe-uni/YDR-Cla-rev bzw.<br />
YNR-Spe-uni/YNR-Cla-rev statt. Als Template diente die genomische DNA des Stammes<br />
DBY747 (für YCR010c) bzw. BY4741 (für YDR384c und YNR002c). Die Klonierung <strong>der</strong><br />
PCR-Produkte erfolgte über die Schnittstellen SpeI und ClaI in den Vektor p426MET25<br />
(p426METYCR, p426METYDR, p426METYNR).<br />
Ort-spezifische Mutagenese <strong>der</strong> Homologen YCR010c und YNR002c<br />
Es sollten in Ycr010cp und Ynr002cp analog den Mutationen in den Allelen GPR1-1 und<br />
GPR1-2 die Aminosäuren L75 (YCR010c) bzw. L74 (YNR002c) durch Q sowie G259 durch D<br />
ausgetauscht werden.<br />
Die Mutation in Ycr010cp <strong>von</strong> L75 in Q erfolgte mit Hilfe einer OEP (vgl. Kapitel 2.9.4). Zuerst<br />
wurden zwei Subfragmente mit Hilfe <strong>der</strong> Primer YCR-Spe-uni/YCR238-rev und YCR-226uni/YCR-Cla-rev<br />
unter Verwendung <strong>von</strong> p426METYCR als Template erzeugt. Danach fand<br />
eine PCR mit diesen beiden Subfragmenten und den Primern YCR-Spe-uni und YCR-Clarev<br />
statt. Das PCR-Produkt wurde über die Schnittstellen SpeI und ClaI in den Vektor<br />
p426METYCR inseriert (p246METYCR-Q75). Zum Austausch <strong>von</strong> G259 in D wurden die Pri-<br />
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