Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

Diskussion
Veränderung konnte aber nicht den negativen Effekt der erneuten Transformation des auf
einem Plasmid kodierten Mutantenallels aufheben. Die angestrebte Mutation in einem anderen
genomischen Gen zur Identifikation von Interaktionspartnern trat somit nicht auf.
4.3 Expression der Mutantenallele von GPR1 und dessen Orthologen in
Saccharomyces cerevisiae
Zu Beginn der Untersuchungen zur Funktion der GPR1-Orthologen in S. cerevisiae stellte
sich die Frage, inwieweit die Mutantenallele von GPR1 (GPR1-1, GPR1-2) aus Y. lipolytica in
S. cerevisiae funktionell sind. Die ORFs von GPR1, GPR1-1 und GPR1-2 wurden in den
S. cerevisiae-Vektor p426MET25 unter der Kontrolle des MET25-Promotors kloniert. Trans-
formanden der Stämme YN bzw. YNΔycrΔydrΔynr, welche die entsprechenden GPR1-
Mutantenallele (GPR1-1 bzw. GPR1-2) exprimierten, waren sensitiv gegenüber Essigsäure.
Somit zeigen S. cervisiae-Transformanden, die für mutiertes Gpr1p kodieren, den gleichen
Phänotyp wie Y. lipolytica. Es lässt sich daher schlussfolgern, dass die Gpr1-Mutantenproteine
in S. cervisiae möglicherweise die gleiche Funktion ausüben wie in der Hefe Y. lipolytica.
Zur weiteren Aufklärung einer möglichen Funktion der Gpr1p-Orthologen in S. cerevisiae
wurde eine Ort-spezifische Mutagenese von Ycr010cp und Ynr002cp durchgeführt. Es wurden
analog der Mutationen in GPR1-1 und GPR1-2 die Aminosäuren L74 bzw. L75 durch Q
sowie G259 durch D ausgetauscht. In dem Protein Ydr384cp konnte kein Aminosäureaustausch
vorgenommen werden, da es an den entsprechenden Stellen keine zu Gpr1p homologen
Aminosäuresequenzen besitzt. Auch die umgebenden Aminosäuresequenzen weisen
keine Homologien auf. Zum Zeitpunkt dieser Versuche lagen keine Daten zur Expression
von YCR010c und YNR002c vor. Für die Untersuchungen der Auswirkungen der Ortspezifischen
Mutagenese musste allerdings eine Expression dieser Allele in jedem Fall erfolgen.
Aus diesem Grund wurde zur Klonierung das Plasmid p426MET25 (Mumberg et al.,
1994), welches ein high-copy Plasmid mit dem konstitutiv exprimierenden MET25-Promotor
ist, verwendet.
Transformanden, die die mutierten Allele von YCR010c und YNR002c (YCR-Q75, YCR-
D259, YNR-Q74, YNR-D259) trugen, waren nicht mehr in der Lage auf Minimalmedium mit
Acetat oder Acetat/Glucose als C-Quellen zu wachsen. Dieser ebenfalls mit den Mutantenallenen
von GPR1 beobachtete Phänotyp lässt auf eine Gpr1p-ähnliche Funktion der beiden
Homologen Ycr010cp und Ynr002cp in S. cerevisiae schließen.
Weiterhin wurde getestet, ob dieser Mutantenphänotyptyp auch unter natürlichen Bedingungen,
d. h. unter den authentischen Promotoren, auftritt. Die Allele wurden auf einem low-
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