Funktionelle Analyse von Proteinen der Gpr1/Fun34/yaaH ...

Material und Methoden
1 x Readersalzen aufgenommen und die Zellzahl auf 1 x 10 7 Zellen/ml eingestellt. Es wurden
von dieser Zellsuspension jeweils 10 µl auf GM-Platten (insgesamt 20 Tropfen pro Platte)
getropft und bei 28 °C inkubiert.
Alle Lösungen für die Ammoniumbestimmung wurden mit ddH2O hergestellt.
Nach 12tägiger Inkubation wurden die Zellen einer Platte in einem mit 1 ml 10 mM MES-
Puffer gefüllten Eppendorf-Reaktionsgefäß suspendiert und 5 min bei 3000 x g abzentrifugiert.
Nachdem das Pellet in 1 ml 10 mM MES-Puffer aufgenommen war, wurde die Zelldichte
auf 10 9 Zellen/ml in einem Gesamtvolumen von 1 ml eingestellt. Dieser Ansatz wurde bei
28 °C geschüttelt und es wurde nach 0, 5, 10, 15, 20 und 25 min jeweils 150 µl Probe entnommen.
Diese Proben wurden 3 min bei 6400 x g zentrifugiert und 100 µl vom Überstand
mit 900 µl 10 mM MES-Puffer verdünnt. Danach wurden die Proben mit 40 µl Nessler-
Reagenz versetzt. Nach 10minütiger Inkubation wurde die Extinktion bei 425 nm gemessen.
Die Bestimmung des Ammoniumgehaltes erfolgte durch den Abgleich mit einer Standardeichkurve
die unter Verwendung von 0, 0,5, 1, 2, 3 und 4 mg Ammonium angefertigt wurde.
Ammonium-SL (1 mg NH4 + /ml): Ammoniumchlorid im Exsiccator getrocknet und davon
2,9654 g mit ddH2O auf 1 l aufgefüllt.
GM-Agarplatten: Agar 2 %
CaCl2 30 mM
Glycerol 3 %
Hefeextrakt 1 %
MES-Puffer-SL:
Von CaCl2 und Glycerol wurden einzelne SL (500 mM
CaCl2 bzw. 50 % Glycerol) hergestellt und diese nach
dem Autoklavieren zum Medium gegeben.
100 mM MES-Puffer
pH-Wert auf 6,0 eingestellt
Nesslers-Reagenz: Nesslers-Reagenz A und B zu gleichen Teilen frisch
gemischt
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