Ergebnisbericht 2010/11 - Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung

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102 WISSENSCHAFTLICHER ERGEBNISBERICHT | Infektion und Immunität | Strategien für Prävention und Therapie 04.1 Molekulare Mechanismen der Hepatitis-C-Virus- Infektion und -Replikation PROJEKTLEITER | Prof. Dr. Thomas Pietschmann | Abteilung für Experimentelle Virologie | Twincore | tpi07@helmholtz-hzi.de PROJEKTMITARBEITER | Dorothea Bankwitz | Dr. Julia Bitzegeio | Dr. Christiane Brohm | Dr. Sandra Ciesek | Martina Friesland | Dr. Sibylle Haid | Kathrin Hüging | Dr. Eike Steinmann Das Hepatitis-C-Virus (HCV) infi ziert neben dem Menschen nur Schimpansen. Das derzeit einzige Tiermodell sind „humanisierte“ Mäuse ohne Immunsystem, denen primäre humane Leberzellen transplantiert werden, in denen sich HCV vermehren kann. Dieses System ist jedoch für die Impfstoffentwicklung ungeeignet, da mit diesen Tieren wegen des Immundefektes keine immunologischen Studien durchgeführt werden können. Wir untersuchen, warum HCV sich in murinen Leberzellen nicht vermehrt. Auf diesem Weg wollen wir verstehen, wie HCV entscheidende Kofaktoren nutzt und gleichzeitig lernen, welche Barrieren überwunden werden müssen, um ein immunkompetentes Kleintiermodell für HCV zu entwickeln. Der HCV-Zelleintritt in Mauszellen funktioniert nicht ohne humane Zelleintrittsfaktoren, da die Proteine auf der Oberfl äche des Virus nur schlecht zu den entscheidenden Mausproteinen auf den Mausleberzellen passen. Damit HCV in Leberzellen eindringen kann, muss das Virus mit vier verschiedenen Molekülen auf der Oberfl äche der Zielzelle interagieren. Diese zellulären Proteine sind SR-BI, CD81, Claudin-1 und Occludin. Besonders CD81 und OCLN sind für die Spezies-Spezifi tät verantwortlich. Unsere neuen Ergebnisse zeigen, dass Claudin-1 aus der Maus nur bedingt von HCV für den Zelleintritt genutzt wird, so dass auch Claudin-1 zur HCV Spezies-Spezifi tät beiträgt. Adaptation von HCV an murine Zelleintrittsfaktoren In diesem Kontext haben wir versucht, das Virus an die Maus anzupassen. Hierfür wurde zunächst eine Leberzelllinie hergestellt, die zwar über humanes SR-BI, Claudin-1 und Occludin verfügt, der aber das menschliche CD81 fehlt. Anschließend haben wir künstlich die Mausvariante des CD81 eingeschleust. Daraufhin ließen sich die Zellen wieder infi zieren – allerdings war die Effi zienz verglichen mit dem humanen CD81 etwa 100-fach niedriger (Abb. 1). Durch serielle Passage des Virus in diesen Zellen hat sich das Virus so gewandelt, dass es die Mausvariante des CD81 genauso effi zient nutzen konnte, wie die humane Variante (Abb.2, siehe S. 101). Allerdings hat diese Veränderung für das Virus seinen Preis: Das adaptierte Virus ist wesentlich anfälliger gegenüber Antikörpern aus Patienten geworden. Vermutlich hat die Anpassung an das Maus-CD81 besonders empfi ndliche Bereiche auf der Virusoberfl äche freigelegt, so dass das Virus nun durch Antikörper besser ausgeschaltet werden kann. Möglicherweise ist diese „geöffnete“ Struktur, welche Konformationswechsel erleichtert, entscheidend für die Nutzung nicht-humaner Eintrittsfaktoren. human cells with mouse CD81 infectivity (TCID 50 /ml) 10 8 10 7 10 6 10 5 10 4 10 3 HCV CD81 serial virus passage before after infectivity (TCID 50 /ml) 10 8 10 7 10 6 10 5 10 4 10 3 CD81 sequencing C E1 E2 NS2 NS3 NS4B NS5A NS5B adapted virus genome Abb. 1. Adaptation des HCV an CD81 aus der Maus. HCV wurde in humane Leberzellen transfi ziert, die murines CD81 anstelle des humanen CD81 tragen. Der Zellkulturüberstand dieser Zellen wurde seriell auf den humanen Zellen mit Maus-CD81 passagiert. Der Erfolg der Adaptation wurde durch Infektion von Zellen, die entweder humanes oder murines CD81 tragen, überprüft (unten). Nach der Adaptation wurde das virale Genom isoliert und sequenziert. Drei Mutationen im Bereich der Hüllproteine wurden identifi ziert, welche für die Adaptation an Maus-CD81 verantwortlich sind; sie sind mit einem Stern im Virusgenom markiert (unten rechts). Perspektive Prinzipiell sollte es also möglich sein, das Virus an weitere nicht-humane zelluläre Replikationsfaktoren anzupassen. Auf diese Weise können wir lernen, wie sich HCV die entsprechenden Wirtsfaktoren zunutze macht und warum dies etwa in Mauszellen nicht gelingt. So werden die Hürden für die Entwicklung eines immunkompetenten Kleintiermodells erkennbar und es können langfristig Wege gefunden werden, diese zu überwinden. Bitzegeio J, Bankwitz D, Hueging K, Haid S, Brohm C, Zeisel MB, Herrmann E, Iken M, Ott M, Baumert TF & Pietschmann T. (2010) Adaptation of hepatitis C virus to mouse CD81 permits infection of mouse cells in the absence of human entry factors. PLoS Pathogens 6:e1000978. Haid S, Windisch MP, Bartenschlager R & Pietschmann T. (2010) Mouse-specifi c residues of claudin-1 limit hepatitis C virus genotype 2a infection in a human hepatocyte cell line. Journal of Virology 4(2):964-75. Bankwitz D, Steinmann E, Bitzegeio J, Ciesek S, Friesland M, Herrmann E, Zeisel MB, Baumert TF, Keck ZY, Foung SK, Pécheur EI, Pietschmann T. (2010) Hepatitis C virus hypervariable region 1 modulates receptor interactions, conceals the CD81 binding site, and protects conserved neutralizing epitopes. Journal of Virology 84(11):5751-63. p7 NS4A
WISSENSCHAFTLICHER ERGEBNISBERICHT | Infektion und Immunität | Strategien für Prävention und Therapie 103 04.2 Interaktion zwischen angeborener und adaptiver Immunität PROJEKTLEITER | Prof. Dr. Ulrich Kalinke | Institut für Experimentelle Infektionsforschung | Twincore | ulrich.kalinke@twincore.de PROJEKTMITARBEITER | Dr. Claudia Detje | Dr. Theresa Frenz | Elena Grabski | Sabrina Heindorf | Julia Heinrich | Christian Mers | Claudia Soldner Nach einer Virusinfektion werden in der Regel innerhalb von Stunden Typ I Interferon-Antworten induziert, die für die ersten Tage das Überleben des Wirts sichern. Erst nach ungefähr einer Woche wird das adaptive Immunsystem so weit aktiviert, dass es in der Lage ist, Pathogene zu eliminieren. In früheren Arbeiten haben wir gefunden, dass nach einer viralen Infektion eine kleine Anzahl hoch spezialisierter Immunzellen, die auch als plasmazytoide dendritische Zellen (pDC) bezeichnet werden, große Mengen an schützendem Typ I Interferon produzieren. Praktisch alle genauer untersuchten Viren haben Gegenmaßnahmen zur Hemmung der Induktion oder der Funktion von Interferon entwickelt. Wir erforschen, wie unterschiedliche Viren Typ I Interferon-Antworten induzieren, welche Strategien sie entwickelt haben, Nach intranasaler Infektion von Mäusen befällt VSV Riechnerven, wandert über die Axone bis in den Riechkolben und wird dort in peripheren Bereichen Typ I Interferon-abhängig gestoppt. Bisher ist unklar, ob im Riechkolben gebildetes Inter feron eine kritische Rolle spielt, welcher Zelltyp lokal zur Interferonproduktion angeregt wird und welche molekularen Mechanismen dabei eine Rolle spielen. In der Abbildung ist die histologische Analyse des Riechkolbens einer Maus dargestellt, die mit einem eGFP exprimierenden VSV infi ziert worden ist (oben). Es ist deutlich erkennbar, dass das Virus in der glomerulären Schicht des Riechkolbens gestoppt wird (unten). Fotos: Twincore diese zu unterwandern, und auf welche Weise Interferone das Überleben des Wirts sichern. Mechanismen der Typ I Interferon Induktion und seine protektive Funktion Die molekularen Mechanismen der Induktion von Typ I Interferon können in verschiedenen Geweben sehr unterschiedlich sein. Wir untersuchen in Mausmodellen, wie der Eintritt des Vesikulären Stomatitis Virus (VSV) über das Riechzentrum in das zentrale Nervensystem Interferon-abhängig inhibiert wird. Weiterhin analysieren wir, welchen Einfl uss Typ I Interferon Antworten auf die Funktion von Immunzellen haben. In diesem Zusammenhang haben wir gefunden, dass vom Vakziniavirus abgeleitete attenuierte Erregervarianten, die starke Typ I Interferon- Antworten induzieren, auch eine Typ I Interferon-abhängige Expansion von Virus-spezifi schen T-Zellen zeigen. Dabei spielt die Typ I Interferon-Stimulation sowohl der Antigenpräsentierenden dendritischen Zellen als auch der T-Zellen eine zentrale Rolle. Weiterhin untersuchen wir den Einfl uss von Typ I Interferon auf die Induktion lang anhaltender Antikörperantworten. Diese Arbeiten spielen für die Entwicklung neuer Impfstoffe eine wichtige Rolle. Virus-vermittelte Aktivierung humaner pDC Ein Teil der Patienten mit einer chronischen Hepatitis-C-Virus (HCV) Infektion kann erfolgreich mit einer Interferon-alpha/Ribavirin Kombinationstherapie behandelt werden. Bisher ist aber nur wenig darüber bekannt, ob bei einer HCV-Infektion das körpereigene Interferon-System ausreichend aktiviert wird. Wir untersuchen, welche HCV und/oder wirtskodierten Faktoren die Stärke und Zusammensetzung von HCV-induzierten Zytokinantworten humaner pDC beeinfl ussen. Diese Arbeiten werden in vitro mit primären pDC durchgeführt, die aus Blutproben von gesunden Spendern isoliert wurden. In der Zukunft sollen auch Experimente mit pDC von chronisch HCV-infi zierten Patienten durchgeführt werden. Perspektive Ein verbessertes Verständnis der vielfältigen Funktionen von Typ I Interferon kann helfen, Typ I Interferon-basierte Therapien von Tumorerkrankungen, Autoimmunerkrankungen und Virusinfektionen zu optimieren. Weiterhin liefern vertiefte Erkenntnisse über virale Mechanismen der Immun-Stimulation und -Unterwanderung neue Ansätze für die Impfstoffentwicklung. Frenz, T., Waibler, Z., Hofmann, J., Hamdorf, M., Lantermann, M., Reizis, B., Tovey, M,G., Aichele, P., Sutter, G., & Kalinke, U. (2010) European Journal of Immunology 40, 2769-2777. Waibler, Z., Anzaghe, M., Frenz, T., Schwantes, A., Pöhlmann, C., Ludwig, H., Palomo- Otero, M., Alcamí, A., Sutter, G., & Kalinke, U. (2009) Journal of Virology 83, 1563-1571. Detje, C.N., Meyer, T., Schmidt, H., Kreuz, D., Rose, J.K., Bechmann, I., Prinz, M., & Kalinke, U. (2009) Journal of Immunology 182, 2297-2304.
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kulatur sind solche Zellen nur in b
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