Ergebnisbericht 2010/11 - Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung

06 Instrumentelle Analytik
WISSENSCHAFTLICHER ERGEBNISBERICHT | Technologie-Plattformen 131
LEITER | Dr. Victor Wray | Arbeitsgruppe Biophysikalische Analytik | vwr@helmholtz-hzi.de
WISSENSCHAFTLICHE MITARBEITER | Dr. Heinrich Lünsdorf | Dr. Manfred Nimtz | Priv.-Doz. Dr. Manfred Rohde
Diese Plattform dient zur dreidimensionalen Strukturaufklärung
aller Arten von Naturstoffen und setzt dazu das
Instrumentarium der Massenspektrometrie (MS), Kernresonanzspektroskopie
(NMR), Röntgenkristallographie (X-ray),
Proteinsequenzierung (PS), Elektronenmikroskopie (EM)
und konfokalen Laser-Mikroskopie ein.
Massenspektrometrie und Kernresonanzspektroskopie
Die Struktur der meisten niedermolekularen Naturstoffe
lässt sich routinemäßig durch den Einsatz einer Kombination
aus Massenspektrometrie (MS) und Kernresonanzspektroskopie
(NMR) vollständig aufklären. Die direkte Analyse
großer, intakter Biomoleküle wie Proteine, Oligonukleotide
und komplexer Kohlenhydrate erfolgt routinemäßig mit
MALDI- und ESI-MS. Ein großer Vorteil der Massenspektrometrie
besteht darin, dass dieses Verfahren auch bei kleinsten
Mengen komplexer Verbindungen detaillierte Informationen
liefert. Bei der Identifi zierung und Charakterisierung
von Proteinen kommen automatisierte Mikrotechniken der
Massenspektrometrie zum Einsatz. Es werden 2D-Gele
und “gellose” Techniken der “Proteomik” angewendet. Die
Identifi zierung von Proteinen erfolgt durch Bestimmung
des Molekulargewichts ihrer proteolytischen Teilpeptide
und deren weitere Fragmentierung mit Hilfe von MALDI/
TOF-MS/MS und HPLC-ESI-MS/MS. Die Sekundär- und
Tertiärstruktur von Peptiden und Proteinen lässt sich
mittels mehrdimensionaler NMR-Spektroskopie aufklären,
wenn isotopenangereicherte Materialien ( 15 N und 13 C) zur
Verfügung stehen.
Plattform: Instrumentelle Analytik
NMR
Niedermolekulare
Naturstoffe
Makromoleküle:
Proteine
X-ray Molekulare Komplexe:
Protein-Ligand
Protein-Protein
PS
EM
Supermakromoleküle:
Organellen
Bakterien
MS
Liste und Anwendungsschwerpunkte der Plattformtechniken
zur Erforschung von Naturprodukten Grafi k: HZI
Röntgenkristallographie Der Schwerpunkt der Röntgenkristallographie
liegt auf der Strukturanalyse von Proteinen.
Ein Pipettierroboter und ein Röntgengerät mit
Flächendetektor und Drehanode stehen für Kristallisationsversuche
und Datenerfassung zur Verfügung. Die Messung
hochaufl ösender Daten und die Phasenbestimmung durch
anomale Dispersion erfolgen unter Einsatz externer Synchrotronstrahlungseinrichtungen.
Elektronenmikroskopie Diese Technik ist mit einem Feldemissionsrasterelektronenmikroskop
(FESEM) mit einem
integrierten EDX-Analysesystem für Elementanalysen und
einer Cryo-stage für Cryo-FESEM-Studien ausgestattet. Das
Hauptaugenmerk liegt darauf, eine kompetitive Einheit mit
modernem Methodenspektrum zur Verfügung zu stellen,
um hochaufl ösende morphologische Analysen und Immunlokalisierungen
von Proteinen vornehmen zu können.
Hochaufl ösende FESEM-Techniken werden eingesetzt, um
die Adhärenz und Invasion in Wirtszellen von verschiedenen
pathogenen Bakterien zu untersuchen. Präparationsprotokolle
wurden an die Wünsche der verschiedenen Forschungsgruppen
auf dem Campus angepasst. Des Weiteren wurden
FESEM-Methoden entwickelt, die eine Immunlokalisierung
von Pathogenitätsfaktoren nicht nur auf der bakteriellen
Zelloberfl äche, sondern auch an den Berührungsfl ächen
zwischen bakterieller und Wirtsmembran ermöglichen. Weiterhin
wurde gezeigt, dass mit Protein-Pathogenitätsfaktoren
ummantelte kolloidale Goldnanopartikel ein sehr nützliches
Werkzeug darstellen, um den „cross-talk“ zwischen pathogenem
Bakterium und der Wirtszelle zu studieren. Zusätzlich
ist die Plattform mit einem konventionellen und einem
energiefi lternden Transmissionselektronenmikroskop (TEM,
EF-TEM) ausgestattet. Sie werden einerseits dazu verwendet,
um die FESEM-Studien vor allem in Hinsicht auf die Immunlokalisierung
von Pathogenitätsfaktoren in der Bakterien-
oder der Wirtszelle weiter zu ergänzen. Und wir untersuchen
mit ihnen die intrazellulären Bewegungen („traffi cking“) von
Pathogenen. Andererseits wird TEM zur Beschreibung der
quartären Struktur von Proteinen mit Hilfe der Negativkontrastierung
eingesetzt. Ebenfalls werden hochaufgelöste Elementanalysen
mit Hilfe von „Electron Spectroscopic Imaging“
und „Electron Energy Loss Spectroscopy“ durchgeführt.
Chen, H.-L., Lünsdorf, H., Hecht, H.-J., & Tsai, H. (2010) Porcine pulmonary angiotensin
1-converting enzyme - biochemical characterization and spatial arrangement of the N- and
C-domains by three-dimensional electron microscopy reconstruction. Micron 41, 674-685.
Dietrich, N., Rohde, M., Geffers, R., Kröger, A., Hauser, H., Weiss, S., & Gekara, N. (2010)
Mast cells elicit proinfl ammatory but not type I interferon responses upon activation of
TLRs by bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 107, 8748-8753
Ibrahim, S. R. M., Min, C. C., Teuscher, F., Ebel, R., Kakoschke, C., Lin, W., Wray, V., Erada-
Ebel, R., & Proksch, P. (2010) Callyaerins A-f and H, new cytotoxic cyclic peptides from the
Indonesian marine sponge Callyspongia aerizusa. Bioorganic & Medicinal Chemistry 18,
4947-4956.
Zakikhany, K., Harrington, C.R., Nimtz, M., Hinton, J.C.D., & Römling, U. (2010) Unphosphorylated
CsgD controls biofi lm formation in Salmonella enterica serovar Typhimurium.
Molecular Microbiology 77, 771-786.