Ergebnisbericht 2010/11 - Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung

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70 WISSENSCHAFTLICHER ERGEBNISBERICHT | Infektion und Immunität | Mikrobielle Pathogenese 01.2 Virulenzfaktoren von Streptokokken und Pneumokokken PROJEKTLEITER | Prof. Dr. G. Singh Chhatwal | Abteilung für Medizinische Mikrobiologie | gsc@helmholtz-hzi.de PROJEKTMITARBEITER | Silva Amelung | Dr. René Bergmann | Dr. Simone Bergmann | Dr. Marcus Fulde | Angela Hitzmann | Melanie Lüttge | Dr. Andreas Nerlich | Dr. Patric Nitsche-Schmitz | Priv.-Doz. Dr. Manfred Rohde | Dr. Vivek Sagar | Dr. Susanne Talay Nicht nur Streptococcus pyogenes und S. pneumoniae (Pneumokokken) lösen schwere Infektions- und Folgeerkrankungen im Menschen aus, auch Gruppe C- und G-Streptokokken wie S. dysgalactiae ssp equisimilis (SDSE), S. anginosus oder S. canis sind aufstrebende Humanpathogene. So wird SDSE mit rheumatischen Herzerkrankungen in Verbindung gebracht. Der Begriff „Oralstreptokokken“ umfasst Arten, die Karies, aber auch lebensbedrohliche systemische Infektionen verursachen. Trotz verfügbarer Antibiotika bleibt die Gesundheits- und Lebensgefährdung durch Streptokokken sehr hoch und schafft einen Bedarf an alternativen Therapien. Gegenwärtige Highlights unseres Projektes, das neue Pathomechanismen aufklärt und Wege zu neuen Therapieansätze aufzeigt, sind: Vernachlässigte Erkrankungen Wir konnten zeigen, dass Oralstreptokokken einen Pathomechanismus besitzen, der bislang nur für S. pyogenes und S. pneumoniae beschrieben war. Er beruht auf der Bindung und Aktivierung von Plasminogen aus humanem Blut. Bakterielle Oberfl ächenproteine vermitteln diesen Prozess, der den Streptokokken eine gewebezersetzende Eigenschaft verleiht (Abb. 1), ihre Ausbreitung im Wirt fördert und so ihre Pathogenität erhöht. Besonders effi zient sind dabei diverse M-Proteine, die in S. pyogenes und - wie wir kürzlich nachweisen konnten – in SDSE und S. canis vorkommen. Aktiviertes Plasmin(ogen) auf der Bakterienoberfl äche (hier: S. canis) zersetzt Fibrin und kann so die Verbreitung des Erregers im Patienten fördern. Foto: HZI, Rohde Die Rolle der verschiedenen Gruppe C- und G- Streptokokken bei Humaninfektionen ist nur unvollständig untersucht. Wir haben gezeigt, dass in Südindien, wo solche Infektionen sehr häufi g sind, 80% der Fälle durch SDSE verursacht werden. Überraschend war, dass S. anginosus die Ursache für die übrigen 20% der Infektionen ist. Deren Diagnose ist bislang schwer, verdient aber nachweislich mehr Aufmerksamkeit in der medizinischen Praxis. Unser kürzlich entwickelter Test für diese Bakterien kann dabei als wertvolles Werkzeug dienen. Die hohe Rate an SDSE-Infektionen ist alarmierend, denn sie verursachen rheumatische Herzerkrankungen. Ursache sind SDSE-Stämme, die Kollagen über PARF (peptide associated with rheumatic fever) binden. Die Häufi gkeit solcher Stämme und der rheumatischen Herzkrankheit in Südindien weisen auf eine entscheidende Rolle dieses Pathomechanismus hin. Endothel-Interaktionen Invasive Infektionen sind häufi g mit einer Verbreitung der Bakterien über die Blutbahn ver bunden. Dort sind sie der Immunabwehr ausgesetzt. Um dieser zu entgehen, dringt S. pyogenes in die innere Zellschicht der Blutbahn (Endothel) ein. Dazu lösen die Bakterien einen Phagozytose-ähnlichen Prozess aus. Wir konnten zeigen, dass das Protein SpyCep daran beteiligt ist (Abb. 2). Dieser Faktor wird auch deshalb mit invasiven Infektionen in Verbindung gebracht, weil er den Botenstoff IL-8 abbaut und auch so der Immunabwehr entgegenwirkt. Invasion von SpyCep-tragendem S. pyogenes (links) und SpyCep-gekoppeltem Latexpartikel (rechts) in humane Endothelzellen Foto: HZI, Rohde Pneumokokken verursachen schwere Lungenentzündungen und beeinfl ussen das Genexpressionsprofi l der Lungenendothelzellen, wie wir mit Hilfe eines Humangenom-Microarrays feststellen konnten. Phosphoglyceratkinase, ein zytoplasmatisches Enzym der Pneumokokken, das auch auf ihrer Oberfl äche vorkommt, wurde außerdem als Plasminogenbinder identifi ziert. Zusammenfassend bietet die Aufklärung der Interaktionen von Streptokokken mit humanem Endothel und Plasminogen neue Ansätze für Therapien, die invasiven Infektionen entgegenwirken. Die Untersuchung vernachlässigter Streptokokkenpathogene erweitert den Blick auf die Schlüsselmechanismen der Streptokokkeninfektionen und gibt neue Anregungen für deren Diagnostik und Behandlung. Bergmann, R, Dinkla, K, Nitsche-Schmitz, DP, Graham, RM, Lüttge, M, Sanderson- Smith, M, Nerlich, A, Rohde, M, Chhatwal, GS (2010) Biological functions of GCS3, a novel plasminogen binding protein of Streptococcus dysgalactiae ssp. equisimilis. International Journal of Medical Microbiology. doi:10,1016/j.ijmm.2010.06.007 Itzek A, Gillen CM, Fulde M, Friedrichs C, Rodloff AC, Chhatwal GS, Nitsche-Schmitz DP (2010) Contribution of plasminogen activation towards the pathogenic potential of oral streptococci. PLoS One 5: e13826
WISSENSCHAFTLICHER ERGEBNISBERICHT | Infektion und Immunität | Mikrobielle Pathogenese 71 01.3 Molekulare Mechanismen des intrazellulären Transports, des Überlebens und der Persistenz von Streptokokken PROJEKTLEITER | Priv-Doz. Dr. Manfred Rohde | Abteilung für Medizinische Mikrobiologie | mro@helmholtz-hzi.de PROJEKTMITARBEITER | Katja Branitzki-Heinemann Streptococcus pyogenes, ein Gruppe A-Streptococcus (GAS), ist der Hauptverursacher von Streptokokken-Infektionen beim Menschen. Diese reichen von leichten bis zu schweren, sogar lebensbedrohlichen Infektionen, wie z.B. der nekrotisierenden Fasziitis. Streptokokken können auch rezidivierende Infektionen, wie z.B. Erysipel und Tonsillitis, verursachen. Dieses Phänomen wird als „carrier-Status“ der Streptokokkeninfektion beschrieben. Es ermöglicht, dass GAS nicht nur intrazellulär Überleben kann, sondern auch einer längeren Antibiotikabehandlung widerstehen kann. Die Untersuchung des „carrier-Status“ der Streptokokken wurde in der Vergangenheit mehr oder weniger vernachlässigt. Über die beteiligten Mechanismen und Faktoren ist nicht viel bekannt. Invasions- und Überlebensmechanismen der Streptokokken Es konnte nachgewiesen werden, dass die Fibronektin-bindenden Proteine der Streptokokken eine wichtige Rolle bei der Adhäsion und Invasion spielen. Das Streptokokken-Fibronektin-Bindungsprotein (SfbI) aus Gruppe A-Streptokokken vermittelt eine Adhäsion und Invasion durch Einstülpungen der Membran (A) in die Wirtszelle. Beteiligt sind Caveolae, und die Streptokokken verbleiben in einem Kompartiment, welches als Caveosom bezeichnet wird. SfbI benutzt dazu Fibronektin als Brückenmolekül zur Bindung an α 5 β 1 -Integrine. Durch die Nutzung dieses Caveolae-vermittelten Weges umgehen die SfbI-tragenden Streptokokken den lysosomalen Abwehrmechanismus der Wirtszelle, da es zu keiner Fusion mit Lysosomen kommt. Gruppe C-Streptokokken exprimieren das Protein GfbA an der Oberfl äche, das ebenfalls Fibronektin bindet und dann mit den α 5 β 1 -Integrinen interagiert. Jedoch zeigen invadierende Streptokokken das sogenannte „membrane ruffl ing“. Das sind Umlagerungen des Wirtszellzytoskeletts, obwohl ähnliche Mengen Fibronektin wie bei den SfbI-tragenden Stämmen gebunden werden (E). Die GfbA-exprimierenden Streptokokken folgen dem klassischen, endozytischen Weg mit der Fusion von Phagosom mit dem Lysosom. Die heterologe Oberfl ächenexpression des GfbA-Proteins in dem nicht pathogenen S. gordonii Stamm hat gezeigt, dass allein GfbA für den andersartigen morphologischen Invasionsmechanismus verantwortlich ist. Die Sequenzierung der GfbA-Gene zeigt, dass nur der C-terminale Teil eine starke Ähnlichkeit mit SfbI aufweist, während der N-terminale Bereich nur zu 60% ähnlich ist. Herstellung von chimären SfbI- und GfbA-Proteinen Anhand der Sequenzierdaten wurde die aromatische Domäne im N-terminalen Bereich als Vermittler des anderen Invasionsweges vermutet. Deshalb wurde einerseits ein GfbA- Protein ohne die aromatische Domäne hergestellt (GfbApro). Andererseits wurde die aromatische Domäne im SfbI-Protein durch die aromatische Domäne von GfbA ersetzt (SfbIGaro). Die GfbApro vermittelte Invasion zeigte nun wieder die typische Caveolae-vermittelte Invasion (F) ohne Fusion mit den Lysosomen (G). Die SfbIGaro vermittelte Invasion zeigte dagegen nun „membrane ruffl ing“ (B) mit Lysosomenverschmelzung (C). Mit Hilfe von SfbIGaro-Goldnanopartikeln konnten wir nachweisen, dass die SfbIGaro-vermittelte Bindung an Fibronektin, wie ebenfalls die GfbA-vermittelte, nicht zu einer Integrin-Klusterbildung führt (D). Die GfbApro vermittelte Bindung jedoch schon (H). Damit wurde erstmalig in einem Fibronektin-bindenden Protein eine biologische Funktion der aromatischen Domäne gezeigt. Weiterhin gibt es erste Hinweise darauf, dass Streptokokken, die mit „membrane ruffl ing“ invadieren, immer mit den Lysosomen zu einem Phagolysosom fusionieren. A) SfbI-exprimierende Streptokokken dringen in Wirtszellen durch die Ausbildung von Einstülpungen der Wirtszellmembran ein. E) GfbA-exprimierende Streptokokken invadieren in Wirtszellen über die Ausbildung von „membrane ruffl e“, Umlagerungen des Zytoskeletts der Wirtszelle. B) heterologe Expression von SfbI mit der aromatischen Domäne von GfbA (SfbIGaro) auf der Zelloberfl äche von S. gordonii führt ebenfalls zu einer Invasion über „membrane ruffl e“ und einer nachfolgenden intrazellulären Fusion mit Lysosomen; Streptokokken sind rot eingefärbt, während Lysosomen mit Lamp-1 grün gekennzeichnet sind (C). F) die Deletion der aromatischen Domäne in GfbA (GfbApro) führt zu einer Invasion über Einstülpungen wie für SfbI beschrieben und es erfolgt keine Fusion mit den Lysosomen (G). D) die Bindung von SfbIGaro über Fibronektin an Integrine führt zu keinem Integrin-clustering, nur einzelne Goldpartikel sind detektierbar (Pfeile), wohingegen GfbApro ein Integrin-clustering aufweist, große Goldaggregate (H, Pfeile). Fotos: HZI, Rohde Nerlich, A., Rohde, M., Talay, S., Genth, H., Just, I., Chhatwal, G.S. (2009) Invasion of endothelial cells by tissue invasive M3 type Group A streptococci requires Src kinase and activation of Rac1 by a PI3-kinase independent mechanism. J. Biol.Chem., 284, 20319-20328
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